頂空毛細管氣相色譜法測定美司鈉原料和注射液的殘留溶劑

張秉華，王小亮，郭歡迎，馬 麗

(1.陜西省食品藥品監督檢驗研究院，西安 710065；2.咸陽市中心醫院藥學部，咸陽712000)

美司鈉(mesna，化學名2-巰基乙磺酸鈉)，別名美斯納和巰乙磺酸鈉。美司鈉的原研企業為美國Baxter Hithcare公司，商品名為Mesnex，目前已在多個國家上市，我國目前批準的美司鈉制劑僅有美司鈉注射液1種劑型，該劑型有2個規格，分別為4 mL∶0.4 g和2 mL∶0.2 g。國內最先仿制的企業為江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。美司鈉可防止用高劑量異環磷酰胺或環磷酰胺進行腫瘤化療時引起的出血性膀胱炎等泌尿系統上皮毒性[1]。與抗腫瘤化療藥異環磷酰胺或環磷酰胺合用，作為泌尿系統保護劑[2]，是一種可去除丙烯酸等的毒性或防止它形成但又不干擾母體藥物治療效果的新型抗毒劑[1-4]。

在藥品質量研究中，殘留溶劑的控制是一個關鍵的安全性質控項目。根據國內美司鈉原料的生產工藝，其在生產過程中用了多種有機溶劑，但國內僅有國家食品藥品監督管理局標準YBH03952007[5]項下對殘留溶劑乙醇進行了控制，其他現行標準[5-10]中均未對殘留溶劑進行控制。美司鈉注射劑作為可靜脈推注的注射劑，應當加強控制安全性。殘留有機溶劑均是對人體有害的，故對美司鈉原料和注射液進行殘留有機溶劑檢測。實驗結果表明，以水為溶劑的殘留溶劑氣相色譜測定方法簡便快速、結果準確、重復性好，可很好地測定美司鈉原料及美司鈉注射液中的殘留溶劑。

1 儀器與試藥

1.1儀器 GC-2010Plus氣相色譜儀，AOC-5000Plus自動進樣器，Lab Solutions島津色譜工作站,FID檢測器(日本島津公司)；全自動空氣源HA-300型(北京中惠普分析技術研究所)；AE-240電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2試藥 美司鈉原料由江蘇恒瑞醫藥股份有限公司提供，批號分別為20150101，20150206和20150210。美司鈉注射液來自國內3個生產廠家，其中江蘇恒瑞醫藥股份有限公司8批，批號分別為MS150402，MS150401，MS150603，MS150602，MS150601，MS140403，MS140602和MS150403；齊魯制藥(海南)有限公司5批，批號分別為B1H1507002，B1H1406002，B2H1505004，B2H1501001和B2H1503003；山西普德藥業股份有限公司3批，批號分別為3140901，7140501和3150701；甲醇(批號E7SJ31，體積分數99.9%)，色譜純，購自韓國德山DUKSAN；乙醇(批號20150824，體積分數99.7%)，丙酮(批號20150824，質量分數99.7%)，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；異丙醇(色譜純)，批號SHBF3579V，質量分數99.9%，購自SIGMA公司；水為純化水。

2 方法與結果

2.1色譜條件的選擇與優化

2.1.1確定樣品中涉及的殘留溶劑種類 美司鈉原料的生產工藝國內采用二溴乙烷與亞硫酸鈉反應生成2-溴乙基磺酸鈉，再與硫脲反應生成2-S-Z磺酸硫脲鹽，將2-S-Z磺酸硫脲鹽與氨水反應生成巰乙磺酸胍氨化產物，再通過與Cationresin和氫氧化鈉反應得到美司鈉[11]。結合美司鈉原料合成、純化過程，參考《中國藥典》2015年版四部附錄殘留溶劑測定法的指導原則[12]及有關文獻[13-18]，由于理論上美司鈉注射劑為水針，制劑過程不應再引入其他殘留溶劑，注射劑中的殘留溶劑均應來自原料藥或輔料中引入的極微量殘留，因此擬對美司鈉合成中用到的甲醇、異丙醇、丙酮以及純化工藝中用到的乙醇4種有機溶劑建立相應的頂空氣相色譜法進行測定。

2.1.2氣相色譜檢測法的建立

2.1.2.1色譜柱的選擇 通過比較不同填料及材質的填充柱(玻璃柱和不銹鋼柱)以及不同極性的石英毛細管色譜柱，待測組分在高分子多孔小球不銹鋼(或玻璃)填充柱中各組分分離效果不夠理想，同時峰形較寬、柱效低。若選擇極性毛細管柱或中等極性毛細管柱則分離情況不如HP-1的非極性石英毛細管柱。故最終選擇HP-1(30 m×0.25 mm，0.25 μm)石英毛細管柱。

2.1.2.2溶劑的選擇 由美司鈉的溶解性可知，其在水中易溶。待測的甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮均能與水互溶，且水本身在FID檢測器中沒有信號響應，可很好地提高方法的檢測限，因此選擇水做溶劑本身對本實驗無干擾。

2.1.2.3頂空條件的選擇 由于溶劑選擇水，且4個待測有機溶劑揮發性均較好，頂空條件選擇藥典推薦條件，頂空瓶溫度為75 ℃，平衡時間為30 min。

2.1.2.4優化色譜條件 在60 ℃等溫條件下各待測組分無法做到基線分離，且出峰過快，選用30 ℃柱溫，分離好，出峰時間合適，但考慮到實驗條件較為苛刻，最終選擇柱溫為40 ℃。同時考慮樣品中可能的殘留，選擇待測組分分離后對色譜柱進行程序升溫。經過實驗最終選擇的色譜條件為：進樣口溫度為200 ℃；檢測器為FID，檢測器溫度為250 ℃；載氣為氮氣；色譜柱為HP-1石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，柱溫為程序升溫，初始溫度為40 ℃；保持5 min，再以20 ℃·min-1的升溫速率升至150 ℃。經優化過的色譜條件，各組分分離良好。色譜圖見圖1。

2.2線性關系考察 混合對照品溶液的配制：分別精密稱取甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮4種有機溶劑13.21，9.85，11.54和15.95 mg，置于同一100 mL量瓶中，用純化水溶解并稀釋至刻度，作為混合對照品儲備液。分別吸取上述混合對照品儲備液1，1，2，3和5 mL，分別置于20，10，10，10和10 mL量瓶中，用純化水稀釋并定容至刻度，搖勻，分別作為標準曲線1～5號溶液。標準曲線溶液含甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮線性范圍分別為6.6～66.0，4.9～49.1，5.8～58.0和8.0～80.0 μg·mL-1。按照氣相色譜法進樣測定，以對照品溶液峰面積為縱坐標(y)、質量濃度為橫坐標(x)，建立線性回歸方程。結果見表1。

表1回歸方程與線性范圍

Tab.1 Linear ranges and regression equations of calibration curves

組分回歸方程r線性范圍/μg·mL-1甲醇y1=172.80x1+378.380.999 46.6^66.0乙醇y2=371.58x2+479.340.999 94.9^49.1異丙醇y3=706.80x3-339.880.999 55.8^58.0丙酮y4=1 135.67x4+592.830.999 68.0^80.0

圖1GC圖

A.空白溶液；B.對照溶液；C.江蘇恒瑞醫藥股份有限公司樣品；D.齊魯制藥(海南)有限公司樣品；E.山西普德藥業股份有限公司樣品；1.甲醇；2.乙醇；3.丙酮；4.異丙醇。

Fig.1 GC chromatograms

A.blank solution；B.standard solution；C.sample of Jiangsu Hengrui Medicine Limited Company；D.sample of Qilu Pharmaceutical (Hainan) Limited Company；E.sample of Shanxi Pude Pharmaceutical Limited Company；1.methanol；2.ethanol；3.acetone；4.isopropanol.

2.3檢測限與定量限 取2.2項下制備的混合對照品儲備液，精密量取不同體積并逐步稀釋，按照2.1.2.4項下色譜方法進樣并測定，當所測殘留溶劑的信噪比達到要求時，甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮的檢測限(S/n=3)分別為1.32，0.98，1.16和1.60 μg·mL-1；定量限(S/n=10)分別為3.96，2.94，3.48和4.80 μg·mL-1。

2.4精密度實驗 取標準曲線3號溶液，按照2.1.2.4項下氣相色譜條件測定，重復進樣5次，通過5次測定的峰面積進行計算。結果表明，所測5次甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮峰面積的RSD值分別為1.8%，1.6%，1.9%和1.0%。實驗結果表明，該方法精密度良好。

2.5重復性實驗 取已知殘留溶劑含量的美司鈉原料作為供試品，精密稱定0.2 g，6份，分別置于15 mL頂空瓶中，精密加入標準曲線3號溶液2.0 mL，密封制備成重復性實驗樣品溶液，3 d連續按照2.1.2.4項下氣相色譜方法重復測定樣品中各有機溶劑的含量，測定結果分別為：甲醇加樣回收率分別為98.3%，96.9%和97.7%；乙醇加樣回收率分別為97.9%，100.2%和99.5%；異丙醇加樣回收率分別為100.6%，99.0%和99.8%；丙酮加樣回收率分別為99.8%，100.3%和100.5%。日間重復性的3組分回收數據表明，該色譜方法重復性良好。

2.6回收率實驗 取已知殘留溶劑含量的美司鈉原料作為供試品，精密稱定0.2 g,9份，分別置于15 mL頂空瓶中，分為3組，第1，2和3組分別加入標準曲線2，3和4號溶液2.0 mL，各質量濃度加3份(共9份)，密封制得相當于檢測限度3個水平(50%，100%，和150%)的溶液。依照2.1.2.4項下氣相色譜方法測定并計算回收率。3個水平的甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮的回收率測定結果：低水平分別為98.6%，96.8%，99.7%和99.1%；中水平分別為96.7%，99.9%，100.3%和98.3%；高水平分別為96.5%，98.0%，98.8%和100.0%。實驗結果表明，該色譜方法回收率良好。

2.7美司鈉原料及注射劑殘留溶劑的測定 分別取美司鈉原料0.2 g，精密稱定，置于15 mL頂空瓶中，加水2.0 mL，密封，作為原料供試品溶液；取美司鈉注射液2.0 mL，密封，作為注射劑供試品溶液。按照2.1.2.4項下氣相色譜條件進行測定，各企業美司鈉注射液中殘留溶劑的種類不一致，差異較大。

江蘇恒瑞醫藥股份有限公司提供的3批原料及8批注射劑殘留溶劑均為乙醇，在該企業提供的原料藥生產工藝中，原料結晶用了乙醇，殘留的乙醇可能為美司鈉原料中的乙醇殘留。注射劑中乙醇的殘留最大質量濃度為24.305 μg·mL-1。

齊魯制藥(海南)有限公司5批注射劑中殘留溶劑均為甲醇，在該企業提供的原料藥標準中，控制了乙醇的含量，此次檢測中乙醇質量濃度均小于5 μg·mL-1，樣品中甲醇殘留最大質量濃度為19.769 μg·mL-1。

山西普德藥業股份有限公司的3批注射劑殘留溶劑測定結果差異較大，一批中甲醇、乙醇及異丙醇3種溶劑均有檢出；一批中檢出了甲醇及乙醇；另一批中僅檢出乙醇。樣品中甲醇、乙醇和異丙醇殘留最大質量濃度分別為12.52，36.67和5.545 μg·mL-1。

3 討論

美司鈉原料及其注射劑標準收載情況：根據標準的查詢情況，《美國藥典》40NF35、《英國藥典》2017年版和《歐洲藥典》9.0版中均收載了美司鈉原料藥的質量標準，但均未收載注射劑質量標準。其中《歐洲藥典》9.0版和《英國藥典》2017年版內容完全一樣。《日本藥局方》中該品種原料和注射劑均未收載。

國內美司鈉原料現行版標準為國家食品藥品監督管理局標準YBH03952007[5]和WS-024(X-017)-95[6]。美司鈉注射液質量標準WS-250-(X-018)-95(1)(2)收載于《國家食品藥品監督管理總局藥品標準新藥轉正標準》第35冊[7]；同時現行版標準還有批給企業的國家食品藥品監督管理局標準YBH01942009[8]和YBH24302006[9]以及進口藥品注冊標準JX20100098[10]。

無論原料標準或注射液標準，國內所執行的現行版標準中，僅國家食品藥品監督管理局標準YBH03952007[5]項下對乙醇的殘留量進行了控制，其他現行標準中均未對殘留溶劑進行控制。實驗發現，無論原料或注射劑，其殘留溶劑都能夠被檢測到，且甲醇屬于2類殘留溶劑，說明原料藥項下殘留溶劑的檢測存在一定缺陷。

本方法快速、準確，樣品制備簡便，對美司鈉原料和注射劑中的殘留溶劑能夠有效控制，可有效避免殘留溶劑的漏檢情況。