雙波長HPLC法測定防風通圣丸中6種成分的含量

李 帆，緱慧君，許雪峰*

(1.四川大學生物治療國家重點實驗室，成都 610041；2.漢中市食品藥品檢驗檢測中心，漢中 723000)

防風通圣丸出自金代名醫劉完素著名的《宣明論方》，由防風、薄荷、大黃、桔梗、川芎、白術、荊芥穗、麻黃、芒硝、滑石、當歸和石膏等17味藥組成，具有疏風解表、清熱通便之功效，主治風熱壅盛、表里俱實癥[1-2]。其標準收載于《中國藥典》2015年版一部。但藥典中只收載了防風通圣丸中黃芩苷的含量測定，目前文獻中使用HPLC法同時測定防風通圣丸4種以上有效成分尚未見報道[3-4]。本法采用雙波長HPLC法對梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、連翹苷、甘草苷和甘草酸銨6種有效成分同時進行測定，方法簡單、可靠，可更好地用于該產品的質量控制。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-2010A高效液相色譜儀，C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(日本島津公司)；AS-10200BD超聲波清洗儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；BT25S，BS224S電子分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；JY10002電子分析天平(上海舜寧恒平科學儀器有限公司)

1.2試藥 對照品：連翹苷(批號1110821-201213，質量分數95.3%)，梔子苷(批號110749-201718，質量分數97.6%),芍藥苷(批號110736-201539，質量分數96.4%)，黃芩苷(批號110715-201720，質量分數93.5%)，甘草苷(批號111610-201106，質量分數93.7%)和甘草酸胺(批號110731-201418，質量分數93.1%)，均由中國食品藥品檢定研究院提供。防風通圣丸：內蒙古天奇中蒙制藥有限公司(批號12160710)，北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠(批號16080112)，陜西利君現代中藥有限公司(批號161002)；甲醇，乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；磷酸(分析純，成都市科龍化工儀器廠)；水為Millipore制水儀所制超純水。

2 方法與結果

2.1色譜條件 日本島津C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相：乙腈(A)-0.5 mL·L-1磷酸水溶液(B)，梯度洗脫依次為：0～9 min 14%A，8～15 min 19%A，15～35 min 19%～50%A，35～36 min 50%～100%A，36～40 min 100%～14%A。 流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；檢測波長：237 nm(梔子苷、芍藥苷、連翹苷、甘草苷和甘草酸銨)，280 nm(黃芩苷)。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液 分別精密稱取梔子苷、芍藥苷、連翹苷、黃芩苷、甘草苷和甘草酸銨對照品10.36，12.63，10.95，10.76，16.97和10.69 mg，分別置于100，50，50，50，50和50 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，放冷至室溫，加甲醇定容，即得含梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、連翹苷、甘草苷和甘草酸銨質量濃度分別為103.6，243.51，284.19，208.71，318.02和398.09 μg·mL-1的單一對照品儲備液。分別精密量取梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、連翹苷、甘草苷和甘草酸銨儲備液2，1，1，1，1和1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得含梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、連翹苷、甘草苷和甘草酸銨質量濃度分別為20.72，24.35，28.42，20.87，31.80和39.81 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液 取防風通圣丸適量，研細，精密稱取0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分數為70%的乙醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理45 min，放冷至室溫，再稱定質量，用體積分數為70%的乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3陰性樣品溶液 按照防風通圣丸的制法和配比，制成缺梔子、白芍、連翹、黃芩和甘草的陰性樣品，并按照2.2.2項下方法制備陰性樣品溶液。

2.3專屬性實驗 取2.2項下制備好的混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，按照2.1項下方法分別進樣分析，結果見圖1。沒有與對照品溶液保留時間相對應的色譜峰，表明陰性樣品對所測的6種成分無干擾。

圖1HPLC圖

A.對照品(237 nm)；B.對照品(280 nm)；C.缺白芍、梔子、甘草、黃芩和連翹陰性樣品(237 nm)；D.缺白芍、梔子、甘草、黃芩和連翹陰性樣品(280 nm)；E.樣品(237 nm)；F.樣品(280 nm)；1.梔子苷；2.芍藥苷；3.甘草苷；4.黃芩苷；5.連翹苷；6.甘草酸銨。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substance (237 nm)；B.reference substance (280 nm)；C.Paeony，Gardenia，Licorice，Scutellaria and Forsythia negative sample (237 nm);D.Paeony，Gardenia，Licorice，Scutellaria and Forsythia negative sample (280 nm)；E.sample (237 nm)；F.sample (280 nm)；1.geniposide；2.paeoniflorin；3.liquiritin；4.baicalin；5.forsythia；6.ammonium glycyrrhizinate.

2.4穩定性實驗 取防風通圣丸，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液(批號16080112)，室溫放置，在制備后0，2，4，6，8，12，16和24 h按照2.1項下色譜條件進樣20 μL，記錄色譜圖，計算得梔子苷、芍藥苷、甘草苷、黃芩苷、連翹苷和甘草酸銨峰面積的RSD值分別為0.70%，0.24%，0.24%，0.90%，0.89%和0.19%。結果表明，供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.5線性關系考察 取2.2.1項下制備的混合對照品溶液，按照2.1項下色譜條件分別進樣2，5，10，15和20 μL，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(y)、對照品溶液進樣量為橫坐標(x)，繪制標準曲線，得梔子苷、芍藥苷、甘草苷、黃芩苷、連翹苷和甘草酸銨的線性回歸方程分別為：y1=32 145.68x1+3 134.841(r1=0.999 9)，y2=36 934.61x2-7 678.1(r2=0.999 7)，y3=69 791.79x3-1 585.78 (r3=0.999 9)，y4=101 066x4+5 405.024(r4=0.999 9)，y5=28 922.24x5+10 550.18(r5=0.995 8)，y6=23 260.25x6+1 659.84(r6=0.999 9)。結果表明，梔子苷、芍藥苷、甘草苷、黃芩苷、連翹苷和甘草酸銨分別在0.041～0.414，0.048～0.487，0.062～0.622，0.057～0.568，0.042～0.417和0.080～0.796 μg范圍內線性關系良好。

2.6精密度實驗 取2.2.1項下配制的混合對照品溶液，按照2.1項下色譜條件連續進樣6次，測得芍藥苷、梔子苷、黃芩苷、連翹苷、甘草苷和甘草酸銨峰面積的RSD值分別為1.17%，0.11%，0.11%，0.43%，0.11%和0.41%，結果表明，該儀器精密度良好。

2.7重復性實驗 取同一批(批號12160710)防風通圣丸6份，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，用2.1項下色譜條件進樣分析，測得梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、連翹苷、甘草苷和甘草酸銨的含量分別為0.689，0.869，10.170，0.829，0.869和3.207 mg·g-1，RSD值分別為1.04%，1.24%，0.27%，1.34%，0.89%和0.79%。

2.8回收率實驗 取同一批防風通圣丸(批號12160710)，精密稱定質量為0.25 g的供試品6份，分別精密加入梔子苷、芍藥苷、甘草苷、黃芩苷、連翹苷和甘草酸銨對照品溶液，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，取續濾液，按照2.1項下色譜條件進樣分析，進樣量為10 μL，記錄色譜圖并計算回收率，結果見表1。

表1加樣回收率測定結果

Tab.1 Determination results of recovery tests (n=5)

成分稱樣量/g樣品含量/mg加入量/mg實測量/mg回收率/%平均回收率/%梔子苷0.250 10.237 80.207 20.459 7107.199.60.249 40.250 10.207 20.457 7100.20.250 00.242 20.207 20.445 898.30.260 60.246 30.207 20.435 091.10.250 50.240 60.207 20.449 2100.7芍藥苷0.250 10.201 20.194 80.396 4100.298.20.249 40.209 80.194 80.401 798.50.250 00.203 50.194 80.396 599.10.260 60.200 50.194 80.390 697.60.250 50.203 90.194 80.386 795.4甘草苷0.250 10.600 90.636 01.214 696.599.70.249 40.614 40.636 01.272 8104.70.250 00.606 90.636 01.257 5102.30.260 60.609 70.636 01.241 999.40.250 50.609 00.636 01.218 295.8黃芩苷0.250 13.198 42.375 05.583 1100.4100.00.249 43.251 02.375 05.714 3104.80.250 03.394 12.375 05.733 598.50.260 63.420 02.375 05.731 297.30.250 53.407 22.375 05.753 598.9連翹苷0.250 10.243 00.208 70.452 6104.6101.30.249 40.251 20.208 70.458 499.40.250 00.251 00.208 70.474 9107.30.260 60.252 00.208 70.456 998.20.250 50.248 30.208 70.451 197.2甘草酸銨0.250 10.994 20.796 11.840 8106.3107.90.249 41.018 50.796 11.868 4106.70.250 00.997 80.796 11.877 0110.00.260 61.003 40.796 11.898 6108.50.250 51.040 80.796 11.909 5107.9

2.9樣品的含量測定 取批號分別為161002，12160710和16080112的防風通圣丸，按照2.2.2項下方法分別制備供試品溶液，并按照2.1項下色譜條件進樣分析，進樣量為10 μL，分別計算樣品中梔子苷、芍藥苷、甘草苷、黃芩苷、連翹苷和甘草酸銨的含量。結果見表2。

表2防風通圣丸各組分含量測定結果

Tab.2 Determination results of Fangfengtongsheng Pills

批號梔子苷/mg·g-1芍藥苷/mg·g-1黃芩苷/mg·g-1連翹苷/mg·g-1甘草苷/mg·g-1甘草酸銨/mg·g-11610021.0680.5259.4350.3410.5702.059121607100.6590.81910.1670.2450.8663.297160801120.6560.5378.7580.1511.1713.063

3 討論

3.1流動相的選擇 以《中國藥典》2015年版一部為參考，比較了乙腈-水和甲醇-水2種不同的流動相體系，在實驗中發現，與甲醇相比，乙腈的洗脫能力更強，系統分離效果更好。因此在本實驗中使用乙腈-水體系要優于甲醇-水體系。同時在水中加入磷酸改性劑后，各組分的峰形和分離度均有明顯提高[5]，優化色譜條件為乙腈-0.5 mL·L-1磷酸水溶液。

3.2檢測波長的選擇 《中國藥典》2015年版一部中防風通圣丸黃芩苷的含量測定波長選擇為280 nm[1-2]，故本方法選擇280 nm為黃芩苷的測定波長[6-14]，而梔子苷、連翹苷、芍藥苷、甘草苷和甘草酸銨的最大吸收波長分別為238，277，230，237和237 nm[15-19]，經過多次實驗，最終選擇237 nm為桅子苷、芍藥苷、連翹苷、甘草苷和甘草酸銨的檢測波長。

3.3供試品溶液制備方法的選擇 由于芍藥苷的熱穩定性不好，故不考慮回流提取。在實驗中，分別比較了體積分數為50%，70%和100%的甲醇溶液和體積分數為50%，70%和100%的乙醇溶液作為溶劑進行30，45和60 min的超聲提取[20-23]，最終結果以體積分數為70%的乙醇超聲45 min的提取效果較好。因此選擇該方法為供試品溶液的提取方法。

3.4溫度的選擇 分別比較了柱溫為25和30 ℃條件下防風通圣丸供試品中各組分的分離度，發現柱溫在25 ℃時甘草苷和連翹苷分離度較好，故選擇柱溫為25 ℃。