知黃潰瘍合劑的急性毒性實驗研究

胡曉燕，唐志立，郭廷東

(南充市中心醫院藥學部，川北醫學院第二臨床醫院藥學部，南充 637000)

知黃潰瘍合劑是南充市中心醫院自制制劑(專利申請號：201710721232.X)，由熟地黃、知母、黃柏、玄參、茯苓、五味子、巴戟天、白及和川牛膝制成，對復發性口腔潰瘍療效較好。知黃潰瘍合劑原方為該院臨床應用多年的協定處方。為了進一步評價知黃潰瘍合劑的安全性，對其進行了急性毒性實驗研究，以期為臨床用藥提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1儀器 JA1003A電子天平(上海精天電子儀器有限公司)； JY10001電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；XT2000iV全自動血液分析儀(日本希森美康株式會社);7020全自動生化分析儀(日本HITACHI公司);0508-離心機(湖南凱達科學儀器有限公司)。

1.2試藥 知黃潰瘍合劑：黑褐色液體，質量濃度為1.5 g·mL-1(相當于原生藥1.5 g)，由南充市中心醫院提供(批號170323)。谷草轉氨酶(AST)，批號160301;谷丙轉氨酶(ALT)，批號150604;堿性磷酸酶(ALP)，批號160402；總蛋白(TP)，批號160803;白蛋白(ALB)，批號160601;尿素(U-REA)，批號150901;肌酐(CRE)，批號 151004;血糖(GLU)，批號160406；三酰甘油(TG)，批號150902；總膽固醇(CHO)，批號160403。以上試劑均由浙江伊利康生物技術有限公司提供。

1.3動物 KM小鼠，SPF級，體質量為18～22 g，雌雄各半，由四川省中醫藥科學院實驗動物中心提供，動物合格證編號：SCXK(川)2013-19。

2 實驗方法

2.1實驗環境 四川省中醫藥科學院藥理毒理研究所SPF屏障系統[合格證號為SYXK(川)2013-100]。室內溫度為20～22 ℃，相對濕度為40%～70%，12 h明暗交替照明[1]。自由飲水。標準飼料由四川省中醫藥科學院實驗動物中心提供。

2.2急性毒性實驗 按照半數急性毒性實驗要求，先進行毒性實驗預實驗預測本品的致死量 (LD50)[1]。取體質量為18～22 g的小鼠30只，隨機分為3組，每組10只，雌、雄各半，動物適應性飼養3 d，禁食不禁水，16 h 后，分別灌胃給予質量濃度分別為1.5，0.75和0.375 g·mL-1的知黃潰瘍合劑，分別灌胃最大體積(以每克體質量0.04 mL計)，24 h內灌胃2次，相當于3組小鼠公斤體質量日給藥劑量分別為 120，60和30 g。給藥后自由進食和飲水，連續觀察14 d，記錄小鼠死亡數。計算出零致死量(Dn)和全致死量(Dm)，進而計算出半數致死量[2-3]。

2.3最大耐受量的測定 將體質量為18～22 g的小鼠40只，雌雄各半，隨機均分為對照組和知黃潰瘍合劑組。動物在禁食不禁水16 h后，分別灌胃最大體積(以每克體質量0.04 mL計)、最大質量濃度1.5 g·mL-1的知黃潰瘍合劑或等體積蒸餾水。24 h內共給藥2次，觀察并記錄至給藥后14 d小鼠的急性毒性反應情況。

2.4指標測定 觀察小鼠的一般狀態、行為活動、飲食情況和分泌物等。實驗末期將小鼠麻醉，拔眼珠取血，將所取血液以2 000 r·min-1離心10 min，分離血清，采用日立 7020 型全自動生化分析儀進行生化檢測；處死小鼠，取心、肝、脾、肺和腎稱定濕質量，計算臟器指數。

3 結果

3.1急性毒性實驗 部分小鼠灌胃知黃潰瘍合劑后有拉稀便癥狀，約5 h后恢復。在灌胃后14 d觀察時間內，小鼠一般狀態、行為活動和飲食情況等均未見明顯異常，小鼠無死亡；14 d后處死小鼠，肉眼觀察心、肝、脾、肺和腎，均未見明顯的病理學變化。因此無法測出知黃潰瘍合劑的半數致死量，故進行其最大耐受量實驗。

3.2最大耐受量實驗 知黃潰瘍合劑給藥7 d后雌性小鼠體質量增長與對照組比較顯著減慢(P<0.01)，差異有統計學意義；給藥14 d后恢復正常，與對照組比較差異無統計學意義。知黃潰瘍合劑小鼠各生化指標與對照組比較差異無統計學意義，臟器指數與對照組比較差異無統計學意義。結果見表1至表4。

表1知黃潰瘍合劑急性毒性反應

Tab.1 Acute toxic reactions of Zhihuang Ulcer Mixture (n=20)

組別劑量/g(以公斤體質量原生藥計)異常反應及死亡情況恢復情況對照組---知黃潰瘍合劑組120.0部分小鼠拉稀便,無死亡藥后約5 h恢復

注：-依次表示未給予知黃潰瘍合劑灌胃、無異常反應及死亡和不需要觀察恢復情況。

由表1可知，灌胃給予知黃潰瘍合劑部分小鼠有拉稀便癥狀，約5 h后恢復，但小鼠無死亡。

表2知黃潰瘍合劑對小鼠體質量的影響

組別劑量/g(以公斤體質量原生藥計)給藥前體質量/g雌性雄性給藥后7 d體質量/g雌性 雄性給藥后14 d體質量/g雌性雄性對照組-18.0±1.017.1±1.128.7±1.231.6±1.532.5±1.741.0±2.0知黃潰瘍合劑組12018.3±0.517.8±1.326.4±2.0??31.3±1.432.7±2.540.2±2.5

注：與對照組比較**P<0.01；-表示未給予知黃潰瘍合劑灌胃。

由表2可知，與對照組比較，知黃潰瘍合劑給藥7 d后雌性小鼠體質量增長顯著減慢(P<0.01)，差異有統計學意義；給藥14 d后恢復正常，與對照組比較差異無統計學意義。

由表3可知，知黃潰瘍合劑小鼠各生化指標與對照組比較差異無統計學意義。

表3知黃潰瘍合劑對小鼠生化指標的影響

組別生化指標AST水平/U·L-1ALT水平/U·L-1ALP水平/U·L-1CRE水平/μmol·L-1BUN水平/mmol·L-1CLU水平/mmol·L-1CHO水平/mmol·L-1TP水平/g·L-1ALB水平/g·L-1TG水平/mmol·L-1對照組128.6±40.230.7±18.5156.3±28.037.4±9.39.1±1.22.86±0.752.06±0.2543.7±6.328.8±3.01.14±0.25知黃潰瘍合劑組125.1±48.530.2±20.2160.6±24.648.0±6.98.5±0.92.88±0.912.25±0.4144.4±6.328.7±2.91.10±0.27

注：組間比較P>0.05。

表4知黃潰瘍合劑對臟器指數的影響

組別劑量/g(以公斤體質量原生藥計) 臟器指數/mg·g-1心肝脾肺腎對照組-4.90±0.6158.85±7.403.94±0.936.38±0.8413.01±1.67知黃潰瘍合劑組120.04.87±0.7361.43±4.664.00±0.696.16±0.8512.64±1.88

注：組間比較P>0.05；-表示未給予知黃潰瘍合劑灌胃。

由表4可知，知黃潰瘍合劑組對小鼠各臟器指數的影響與對照組比較差異無統計學意義。

4 討論

復發性口腔潰瘍是口腔黏膜疾病中的常見病、多發病，患病率居口腔黏膜病的首位[4]。西醫認為該病的發生與諸多誘因相關[5]，如遺傳[6]、細菌和病毒感染[7]、維生素缺乏[8]、免疫力異常[9-10]和精神壓力[11-12]等，但具體的發病機制仍不清楚，因而目前西醫對該病無特效藥[13-14]。現代中醫在治療口腔潰瘍方面提出了許多見解，如辨證論治[15]、外用藥物治療[16]、針灸治療[17]和中西醫結合治療[18-19]等。

我院名老中醫認為口腔潰瘍的發生責之于素體集熱或陰虛，須通過滋陰清虛熱達到治療目的，擬定知黃潰瘍湯作為協議處方，臨床應用多年，取得較好的療效。現將知黃潰瘍湯制成合劑(藥效學實驗結果另文報道)，以期為患者提供便于儲存、攜帶和服用的治療口腔潰瘍藥物。

研究結果顯示，知黃潰瘍合劑毒性較低，按照常規方法測不出LD50，故以最大給藥量進行急性毒性實驗。給藥后連續觀察14 d，小鼠生化指標、主要臟器指數與對照組比較差異均無統計學意義，主要臟器病理組織學亦未見明顯毒性和不良反應。一般認為，按照體質量計算，小鼠日最大給藥量相當于臨床日用量的100 倍以上則較為安全[20]。本實驗測得小鼠口服知黃潰瘍合劑的最大耐受量為120 g·kg-1原生藥，相當于臨床擬用劑量的109.1倍，提示常規劑量下服用安全可靠。該制劑臨床用藥周期為3 d，故免做長期毒性實驗。