匹伐他汀對2型糖尿病模型大鼠腎臟損傷的保護機制

田 靜，李 影，劉 芳

(保定市第一醫院內分泌科，保定 071000)

在高血糖狀態下，氧化應激是血管內皮功能障礙的原因之一。血糖控制達標可減慢糖尿病腎病(DN)的進展[1-2]。DN可能是一種炎性因子介導的炎癥反應：炎性細胞釋放炎癥因子，炎癥因子促進炎癥細胞的黏附、聚集和激活，兩者互為因果[3]。他汀類藥物能改善患者內皮細胞功能，對炎癥細胞的黏附、聚集有抑制作用。本課題通過建立STZ誘導的糖尿病大鼠模型，觀察在高脂飼料喂養狀態下炎癥因子及氧化應激相關指標的動態變化，探討匹伐他汀對上述指標的影響及可能的作用機制。

1 儀器與材料

1.1儀器 SCR20B型離心機(日本HITACHI公司)；LEICARM 2016石蠟切片機(上海五相儀器儀表有限公司)；光學顯微鏡(日本Olympus公司)；Q55OCW圖像信號采集與分析系統(德國LEICA 公司)。

1.2試藥 匹伐他汀(北京雙鶴藥業股份有限公司，批號160422)；鏈脲佐菌素(美國Sigma公司，批號090412)；大鼠IL-6、VEGF免疫試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司，批號分別為100042和100173)；大鼠MDA、SOD、GSH-PX(南京建成生物工程研究所，批號分別為20140117，20140115和20140109)。

1.3實驗動物 健康雄性Wistar大鼠84只，體質量為110±10 g，均由河北醫科大學第四醫院動物實驗中心提供(動物合格證編號908040)。

2 實驗方法

2.1DM大鼠造模與分組 應用隨機數字表法將大鼠分為正常對照組16只、模型組68只。各組大鼠適應性喂養1周，模型組大鼠均給予40 mg·kg-1鏈脲佐菌素腹腔注射，72 h后尾靜脈采血測定血糖。血糖高于16.7 mmol·L-1為糖尿病模型造模成功。將造模成功的64只大鼠隨機分為糖尿病低脂組、糖尿病低脂干預組、糖尿病高脂組和糖尿病高脂干預組,各16只。2個低脂組大鼠先給予普通飼料喂養8周，然后糖尿病低脂干預組大鼠給予匹伐他汀2 mg·kg-1灌胃，每日1次，糖尿病低脂組給予等量的生理鹽水灌胃，共3周；2個高脂組大鼠先給予高脂飼料喂養8周，然后糖尿病高脂干預組大鼠給予匹伐他汀2 mg·kg-1灌胃，每日1次，糖尿病高脂組給予等量的生理鹽水灌胃，共3周。

2.2各項指標監測 每周監測各組大鼠體質量。實驗性喂養前和喂養12周后，各組大鼠經尾靜脈取血測定血脂、空腹血糖(FBG)、血游離脂肪酸(FFA)、血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)。血漿葡萄糖和血脂指標等均采用相應酶法測定。

2.3尿蛋白檢測 各組大鼠喂養12周后，收集大鼠24 h尿液，檢測24 h尿蛋白含量。

2.4IL-6和VEGF的含量測定 各組大鼠喂養12周后，禁食10 h，給予體積分數為10%的水合氯醛腹腔麻醉，剖腹，腎靜脈取血，采用酶聯免疫吸附法(Elisa法)測定血中IL-6和VEGF的含量。

2.5腎組織勻漿丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的含量測定 應用空氣栓塞法處死大鼠，測定大鼠單腎質量，計算腎肥大指數(腎肥大指數=單腎質量÷體質量)。取適量腎臟組織，用冰生理鹽水清洗，清凈后制成體積分數為10%的腎組織勻漿。測定腎組織勻漿中MDA、SOD和GSH-PX的含量。

2.6觀察腎組織病理改變 部分腎組織依次經固定、脫水、包埋、切片等一系列步驟后，制成HE染色組織切片，置于光鏡下觀察腎臟病變情況。

3 結果

3.1各組大鼠的體質量、腎肥大指數 實驗前，比較各組大鼠體質量，差異無統計學意義(P>0.05)。高脂飼料喂養組大鼠體質量明顯高于其余各組大鼠，且糖尿病高脂組高于糖尿病高脂干預組，差異有統計學意義(P<0.05)。飼養12周后，糖尿病模型組大鼠腎臟肥大指數明顯高于正常對照組，而匹伐他汀干預組大鼠的腎臟肥大指數較匹伐他汀未干預組明顯降低(P<0.05)。提示匹伐他汀可明顯減輕糖尿病大鼠腎臟肥大的程度。見表1。

表1各組大鼠體質量和腎肥大指數

組別體質量/g0周 12周 單腎質量/g腎肥大指數正常對照組105.74±11.34263.01±15.54 2.300 6±0.202▲ 0.853±0.06糖尿病低脂組106.68±9.41238.93±18.86?▲ 2.452 8±0.176 0.993±0.08?▲糖尿病低脂干預組106.09±9.92264.59±13.44 2.497 3±0.249? 0.930±0.07?糖尿病高脂組106.76±10.10352.69±16.38?▲ 3.284 4±0.284▲? 0.929±0.06?糖尿病高脂干預組106.39±11.12325.09±13.65? 2.879 8±0.239? 0.874±0.07

注:與正常對照組比較*P<0．05，差異具有統計學意義；與匹伐他汀干預組比較▲P<0．05，差異具有統計學意義。

3.2血脂、游離脂肪酸檢測結果 高脂飼料喂養的大鼠血脂各項指標明顯高于正常對照組和2個低脂組，給予匹伐他汀處理后，糖尿病高脂組大鼠血脂指標明顯降低(P<0.05)；說明匹伐他汀有明顯的降脂作用。見表2。

3.3血糖結果 糖尿病模型組大鼠經過12周的高脂飼料喂養后，FBG進一步升高。表明匹伐他汀對血糖無明顯影響(P<0.05)。見表2。

表212周后各組大鼠的TC、TG、LDLC、FBG和FFA

組別TC/mmol·L-1TG/mmol·L-1LDLC/mmol·L-1FBG/mmol·L-1FFA/mmol·L-1正常對照組1.57±0.12▲0.62±0.100.98±0.125.13±0.81▲1.23±0.10▲糖尿病低脂組1.69±0.38▲0.62±0.161.03±0.2018.99±1.94?1.16±0.23▲糖尿病低脂干預組1.03±0.290.54±0.150.71±0.1817.96±1.34?1.00±0.22?糖尿病高脂組8.00±0.98?▲1.39±0.10?▲6.11±0.87?▲21.58±2.30?▲2.05±0.18?▲糖尿病高脂干預組5.53±0.90?0.92±0.19?3.53±0.71?20.10±1.77?1.42±0.16?

注：與正常對照組比較*P<0．05，差異具有統計學意義；與匹伐他汀干預組比較▲P<0．05，差異具有統計學意義。

3.4各組大鼠血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白含量測定結果 長期高血糖狀態下糖尿病高脂組大鼠24 h尿蛋白含量明顯高于正常對照組(P<0.05)，血肌酐和尿素氮含量也明顯偏高，進一步加重了糖尿病大鼠的腎臟損傷；經匹伐他汀處理后24 h尿蛋白、血肌酐和尿素氮均有所降低，在一定程度上減輕了糖尿病大鼠的腎臟損傷(P<0.05)。見表3。

3.5各組大鼠血IL-6和VEGF水平 與正常對照組比較，糖尿病模型組血IL-6和VEGF含量明顯偏高(P<0.05)，高脂環境下IL-6和VEGF進一步增高(P<0.05)。糖尿病大鼠腎臟中炎癥因子增多，高脂環境進一步加重了局部的炎癥反應，本研究結果提示匹伐他汀可能具有一定的抗炎作用。見表4。

3.6各組大鼠腎組織勻漿MDA、SOD和GSH-PX含量測定 比較不同飼養條件下糖尿病模型組大鼠的腎臟MDA、SOD和GSH-PX含量，研究提示，長期高糖、高脂環境下糖尿病模型組大鼠腎臟氧化應激反應明顯增強(P<0.05)。匹伐他汀可部分降低氧化應激的程度，通過抑制局部氧化應激反應起到保護腎臟的作用。見表4。

表3各組大鼠血肌酐、尿素、24h尿蛋白測定結果

組別血肌酐/μmol·L-1尿素氮/mmol·L-124 h尿蛋白/g·L-1正常對照組56.45±8.57 6.01±0.8313.95±1.53▲糖尿病低脂組58.39±8.35 5.94±0.8441.80±7.40▲?糖尿病低脂干預組54.55±8.58 5.86±0.7732.39±5.34?糖尿病高脂組99.09±11.61▲?12.24±1.28▲?90.88±10.58▲?糖尿病高脂干預組77.20±9.72? 9.96±1.14?60.92±8.31?

注：與正常對照組比較*P<0．05，差異有統計學意義；與匹伐他汀干預組比較▲P<0．05，差異有統計學意義。

表4大鼠血IL-6、VEGF水平及腎組織勻漿MDA、SOD和GSH-PX含量

組別IL-6/ng·L-1VEGF/ng·L-1MDA/nmol·g-1SOD/U·mg-1GSH-PX(活力單位)正常對照組 66.75±8.36▲19.33±2.52▲13.23±1.54▲208.08±25.45▲316.98±23.04▲糖尿病低脂組 93.17±12.52▲?29.14±2.89▲?19.24±1.50▲?160.64±15.2▲?254.61±18.38▲?糖尿病低脂干預組 81.15±10.92?24.69±2.59?16.61±1.35?182.86±14.91?296.91±21.25?糖尿病高脂組163.86±12.7▲?46.09±3.88▲?24.17±2.34▲?128.35±14.6▲?207.83±18.32▲?糖尿病高脂干預組116.67±15.78?37.97±3.04?19.78±1.77?146.86±15.48?232.42±19.61?

注:與正常對照組比較*P<0．05，差異具有統計學意義；與匹伐他汀干預組比較▲P<0．05，差異具有統計學意義。

3.7各組大鼠腎臟組織形態學比較 與正常對照組大鼠比較，糖尿病低脂組大鼠腎小球可見輕度炎細胞浸潤及纖維化；高脂組腎臟病變進一步加重，除了腎小球，腎間質亦可見明顯炎癥細胞浸潤、纖維化。匹伐他汀干預后上述病變程度均較干預前減輕。從病理形態上進一步說明匹伐他汀可減輕糖尿病大鼠腎臟的免疫炎癥反應，從而在一定程度上延緩糖尿病腎病的進展。見圖1。

圖1大鼠腎組織形態學比較

A.正常對照組(×100)； B.糖尿病低脂干預組(×400)；C.糖尿病低脂組(無匹伐他汀處理,×100)；D.糖尿病高脂干預組(×400);E.糖尿病高脂組(無匹伐他汀處理,×400)。

Fig.1 Comparison of morphology of kidney in rats

A.blank control group (×100)；B.pitavastatin group fed by low dose fat (×400)；C.group fed by low dose fat (fed by normal fat and untreated by pitavastatin,×100)；D.pitavastatin group fed by high dose fat (×400)；E.group fed by high dose fat (fed by high dose fat and untreated by pitavastatin,×400).

4 討論

由炎癥細胞、細胞因子參與的一系列炎癥反應已成為DN發生、發展的重要原因[4-5]。IL-6與糖尿病腎病的發生、發展關系密切。IL-6使DN患者系膜細胞局部氧自由基的生成增多、加重脂質過氧化、損傷細胞內膜；IL-6和TNF-α均可促進免疫復合物的形成，并沉積于腎臟血管內皮形成血栓[6-8]。血管內皮生長因子(VEGF)是體內一種強效促血管生成因子，可使血管內皮的通透性增加。有學者發現，VEGF表達的上調可加重糖尿病腎臟病變[9]。許多炎癥因子相互作用導致免疫失衡，腎臟病變進一步加重[10-12]。多項臨床研究證實了上述觀點[13-14]。

文獻表明，他汀類藥物有抗炎、減輕腎小球硬化和保護腎功能等作用[15-18]。DN早期存在腎小球肥大，可伴有腎小管間質纖維化，晚期可出現腎小球硬化和腎功能衰竭。核因子-κB(NF-κB)可調節多種炎癥因子的轉錄[19]。他汀類藥物能抑制巨噬細胞的浸潤和某些炎性因子如TGF-B1和IL-6等的表達，NF-κB的活性受抑，減輕腎臟局部的炎癥反應。

STZ是最常用的致糖尿病藥物，此類藥小劑量腹腔注射，可部分損傷胰島β細胞，使胰島素分泌減少[20-21]；高脂高糖喂養可誘導實驗動物出現胰島素抵抗[22]，2種方法結合更易獲得2型糖尿病動物模型。研究表明，STZ對肝、腎有一定的毒性[23]。研究提示，STZ誘導的糖尿病大鼠血循環中IL-6和VEGF水平較普通飼料喂養的模型大鼠明顯升高。經匹伐他汀處理后，除了糖尿病大鼠血循環中炎癥因子的水平下降外，腎組織勻漿中的MDA水平也有所降低，GSH-PX和SOD活性增強。高血糖狀態下體內自由基增多易造成氧化損傷，脂質過氧化物可損傷腎臟基底膜和內皮細胞。文獻報道，丹參素通過清除氧自由基、抑制脂質過氧化從而延緩DN的進展[24]。實驗結果表明，匹伐他汀具有一定的抗炎、抗氧化作用。糖尿病引發的腎小球硬化是DN的主要病理特點[25]。本實驗中觀察腎臟的病理形態變化，可見普通飼料喂養的糖尿病大鼠腎臟出現腎小球水腫及炎癥細胞浸潤，而處于高脂環境下的大鼠可見腎血管硬化以及腎間質的纖維化。匹伐他汀(2 mg·kg-1·d-1)干預3周可在一定程度上減輕腎臟局部炎癥病變及纖維化程度。

研究結果提示，匹伐他汀除了降脂作用外，對糖尿病大鼠的腎臟有一定的保護作用，國內學者研究也得出類似的結論[26-28]。考慮其作用機制可能是通過調節一系列的細胞信號轉導通路從而抑制IL-6、TNF-α和VEGF等炎性因子的表達。同時匹伐他汀可抑制腎臟局部的氧化反應，通過抗炎、抗纖維化達到改善腎功能和緩解腎臟病變進一步發展的目的。此外，匹伐他汀未對血糖造成影響，可聯合用于糖尿病腎病的臨床治療。