HPLC法測定黃藤素納米柔性脂質體的含量及包封率

付麗娜，李偉澤,趙 寧，李維鳳

(1.西安交通大學藥學院，西安 710061；2.西安醫學院藥學院，西安 710021)

黃藤素(palmatine)又名掌葉防己堿、巴馬汀、棕櫚堿和非洲防己堿等，是從防己科植物黃藤(FibraurearecisaPierre)的干燥藤莖中提取精制而得[1]。黃藤素具有明顯的抗炎抑菌作用，其抗真菌作用尤佳，還具有體外抗陰道毛滴蟲的活性，安全無毒[2-3]。但由于黃藤素脂溶性較差，生物利用度較低[4]，限制了其臨床應用。納米柔性脂質體具有較高的包封率和穩定性[5-7]，粒徑多為數十至數百納米，外觀為膠體溶液。本實驗利用注入法制備黃藤素柔性納米脂質體，建立黃藤素柔性納米脂質體的含量及包封率測定方法。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；ZEN-3600Malvern激光粒度儀(馬爾文公司)；Quintix224-1CN電子天平、SIGMA1-14離心機(賽多利斯科學儀器有限公司)；52-AA旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；B11-1型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司)；FJ-200高速分散勻質機(上海標本模型廠)；DDS-307電導率儀(上海儀電科學儀器有限公司)；JEM-2000EX透射電鏡(日本電子株式會社)。

1.2試藥 黃藤素對照品(中國食品藥品檢定研究院，質量分數≥98%)；黃藤素(西安小草植物科技有限責任公司，批號XC20140304，質量分數≥98%)；大豆卵磷脂(湖北遠成藥業有限公司)；膽固醇(上海山浦化工有限公司)；1,2-丙二醇(廈門星鯊制藥有限公司)；硫酸魚精蛋白(Sigma公司)；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1黃藤素納米柔性脂質體的制備 稱取卵磷脂3.5 g與膽固醇0.02 g，用無水乙醇10 mL溶解，于-0.05 MPa、50 ℃條件下濃縮，以無水乙醇復溶至10 mL，形成油相。將1，2-丙二醇20 mL加入蒸餾水76 mL中混勻，得水相。取1/3水相，加黃藤素0.2 g溶解，并于50 ℃以100 r·min-1磁力攪拌將油相緩慢注入，水合5 min，以20 000 r·min-1均質5 min，將剩余2/3水相加入，繼續高速均質5 min，最后通過聚丙烯濾膜(0.22 μm)過濾2次，4 ℃保存備用[8-9]。

取少量上述脂質體混懸液，將稀釋液樣品適量滴于銅載網上，晾干后用質量濃度為15 mg·mL-1的磷鎢酸進行負染色，于透射電子顯微鏡下觀察其形態(加速電壓2 kV，分辨率0.2 nm)，結果見圖1。另取適量黃藤素納米柔性脂質體用蒸餾水稀釋，采用激光粒度儀測定其粒徑及表面Zeta電位。結果見圖2。

圖1黃藤素納米柔性脂質體透射電鏡圖

Fig.1 The TEM images of palmatine-loaded flexible nano-liposomes

圖2黃藤素納米柔性脂質體粒徑(A)和電位(B)分布圖

Fig.2 The size (A) and zeta potential (B) distribution of palmatine-loaded flexible nano-liposomes

由圖1可知，黃藤素納米柔性脂質體外觀為圓形或橢圓形，內部具有同心圓的指紋狀結構，其原因可能是由于柔性脂質體加入丙二醇后，使脂質體雙分子膜的柔性和變形性提高[10]。由圖2可知，黃藤素納米柔性脂質體的粒徑集中在200 nm處，表面Zeta電位為-49.7 mV，當Zeta電位的絕對值>30 mV時，納米粒表面存在大量凈電荷，納米粒間存在較大的靜電排斥力，有利于提高納米制劑的穩定性[11-12]。因此，黃藤素納米柔性脂質體囊泡彼此之間的靜電排斥力較大且具有較強的物理穩定性。

2.2黃藤素納米柔性脂質體的含量與包封率測定

2.2.1試劑的配制 魚精蛋白：稱取硫酸魚精蛋白 0.1 g，用蒸餾水溶解，定容于10 mL量瓶中，即得質量濃度為10 mg·mL-1的魚精蛋白溶液。

消解液：吸取Triton X-100 12 mL，用甲醇稀釋至100 mL，即得體積分數為12%的Triton X-100甲醇溶液。

2.2.2色譜條件 Hypersil BDS C18(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)色譜柱；流動相：乙腈(A)-0.4 mL·L-1磷酸(B)(20∶80)；檢測波長：345 nm[13-14]；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL；柱溫：25 ℃。

2.2.3專屬性考察 對照品溶液的制備：精密稱取黃藤素對照品20 mg，置于10 mL量瓶中，用雙蒸水配制成質量濃度為2 mg·mL-1的儲備液。精密量上述儲備液1 mL，置于100 mL量瓶中，用流動相稀釋成質量濃度為20 μg·mL-1的溶液。

樣品溶液的制備：精確量取黃藤素納米柔性脂質體1.0 mL，加入體積分數為12% 的TritonX-100甲醇溶液2 mL，使脂質體膜材溶解，用流動相定容至10 mL，以13 000 r·min-1離心10 min，取上清液，經0.22 μm濾膜過濾。

陰性溶液的制備：按照2.1項下方法不加入黃藤素制得空白脂質體溶液。吸取上述對照品儲備液1 mL，置于10 mL量瓶中，按照2.2.1項下消解液的制備方法，制得陰性溶液。

取上述3種溶液各20 μL，進樣，得HPLC圖。在該色譜條件下，黃藤素能達到基線分離且峰形穩定，脂質體及輔料不干擾黃藤素的測定。

2.2.4線性關系考察 精密稱取黃藤素對照品0.028 g，加蒸餾水配制成質量濃度為0.84，2.8，8.4，14.0和25.2 μg·mL-1的對照品溶液，精密移取各溶液20 μL，注入液相色譜儀中測定，以峰面積為縱坐標(y)、質量濃度為橫坐標(x)，建立標準曲線：y=94.637x-43.44(r=0.999 8)，結果表明，黃藤素在質量濃度為0.84～25.2 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.2.5精密度測定 按照2.2.3項下方法配制高、中和低(25,13.95和0.8 μg·mL-1)3個質量濃度的黃藤素對照品溶液，按照色譜條件測定峰面積，每日(0，2，4，6，8和10 h)進樣，測定峰面積，結果其日間和日內精密度RSD值均小于2%。

2.2.6回收率測定 精密量取9份陰性溶液各1 mL，置于10 mL量瓶中，編號為1～9。每3份中分別精確加入2 mL高、中和低(25.2,14和0.84 μg·mL-1)3個質量濃度的黃藤素對照品溶液，同時加入體積分數為12%的Triton X-100甲醇溶液，搖勻后定容，以13 000 r·min-1離心5 min，取上清液，按照2.2項下方法測得RSD值為0.75%，結果見表1。

表1黃藤素回收率測定結果

Tab.1 Results of recovery test of palmatine

編號加入量/μg·mL-1測得量/μg·mL-1回收率/%平均回收率/%RSD/%12524.65298.60899.040.7522524.73598.94032524.85699.424413.9513.93199.863 80513.9513.92699.827 96613.9513.92299.799 2870.80.78598.12580.80.78397.87590.80.79198.875

2.2.7黃藤素納米柔性脂質體的含量測定 精密吸取黃藤素脂質體0.75 mL，置于5 mL量瓶中，加入體積分數為12%的Triton X-100甲醇溶液消解至澄清透明，搖勻，取20 μL進樣測定，即為脂質體中黃藤素的含量。測定3個批次樣品，結果黃藤素質量濃度分別為98.1，97.5和99.3 g·mL-1，RSD值為0.93%。

2.2.8黃藤素納米柔性脂質體包封率的測定 精確量取黃藤素納米柔性脂質體1.5 mL，置于5 mL離心管中，加入質量濃度為10 mg·mL-1的魚精蛋白溶液1.5 mL，搖勻后靜置3 min，在室溫條件下以13 000 r·min-1離心10 min，見圖3；棄上清液，脂質體沉淀物用體積分數為12%的Triton X-100甲醇溶液2 mL消解至澄清[15]，取20 μL進樣測定，測定3批。包封率計算公式[16]：包封率=(W包封÷W總量)×100%，W包封為包封于脂質體的藥物質量濃度，W總量為實際加入的總藥量的質量濃度。結果3批包封率分別為80.67%，77.88%和78.41%，RSD值為1.88%。

圖3魚精蛋白凝聚法沉淀黃藤素納米柔性脂質體效果圖

Fig.3 The photo of precipitating palmatine-loaded flexible nano-liposomes with protamine aggregation method

蛋白質對脂質體穩定性的影響較為復雜，蛋白質可鍵合或吸附在脂質體表面，使脂質體密度增大；也可部分插入雙分子脂質層或穿透整個脂質膜，從而影響其穩定性[17]，由圖3可知，采用魚精蛋白法能使脂質體與游離藥液明顯分離，且游離藥液澄清透亮。

3 討論

本文以丙二醇為柔軟劑，采用注入法制備黃藤素納米柔性脂質體，制備過程中發現：黃藤素納米柔性脂質體對藥物的包封率隨著丙二醇用量的增加而增大；當丙二醇用量大于20 mL時，包封率開始逐漸降低，因此本次脂質體制備的處方選用丙二醇用量為20 mL。

為了準確測定黃藤素納米柔性脂質體的包封率，須將脂質體和游離的藥物有效分離。常用葡聚糖凝膠柱色譜法、透析法和超速離心法等分離脂質體。其中葡聚糖凝膠柱色譜較為常用，但葡聚糖表面上許多位點能與脂質體膜結合并相互作用，導致膜滲透性的改變和包裹物質的滲漏且脂質體易被稀釋；透析法過程緩慢，適合分離小分子物質；超速離心法易破壞脂質體，且對于小粒徑脂質體特別是納米脂質體分離效果較差[18-19]。魚精蛋白凝聚法主要是通過在脂質體表面吸附某種蛋白質來增加脂質體的密度使游離藥物與脂質體通過離心后達到有效分離。本文用約含2/3以上精氨酸的鮭魚精蛋白，是一種含有胍基的帶正電的堿性氨基酸[20-21]。黃藤素納米柔性脂質體帶有負電荷。多聚陽離子魚精蛋白會與帶負電的脂質體產生絮凝作用，并通過離心將脂質體和游離藥物分離。實驗發現，不同體積的魚精蛋白溶液加入黃藤素納米柔性脂質體，凝聚效果也有差異，魚精蛋白溶液加入過多，對脂質體有稀釋作用，形成的脂質體凝集量較少；魚精蛋白溶液加入過少，雖能有效分離脂質體，但由于游離藥物溶液過少，不利于取樣分析。因此經過多次實驗，最終加入與樣品量同體積的魚精蛋白溶液，能有效分離脂質體和游離藥物，且利于取樣分析。

本實驗所建立的黃藤素分析方法精密度較高，變異系數較小，HPLC法結合魚精蛋白法可快捷、準確地測定黃藤素納米柔性脂質體的含量和包封率，且專屬性強，輔料不會對主藥含量測定產生干擾，可用于黃藤素納米柔性脂質體的質量控制。