微透析法研究六味地黃丸在腎陰虛糖尿病大鼠模型的藥動(dòng)學(xué)

王華富，桂志紅，張小如，葉一萍，丁 汀，儲(chǔ)衛(wèi)華

(1.麗水市人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，麗水 323000;2.麗水市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，麗水 323000;3.麗水市人民醫(yī)院中醫(yī)科，麗水 323000；4.中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 210009)

腎陰虛型糖尿病的癥狀主要為尿頻量多、混濁如脂膏、尿甜、口干、頭暈和腰腿酸痛[1]。六味地黃丸作為治療腎陰虛型糖尿病的主要藥物，其使用劑量依醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)給出。本次實(shí)驗(yàn)利用微透析取樣法，采集腎陰虛型糖尿病大鼠模型的透析液，并處理大鼠的糖尿病效應(yīng)細(xì)胞[2]，檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞的變化情況，進(jìn)而得到六味地黃丸對(duì)腎陰虛型糖尿病效應(yīng)細(xì)胞的 “藥物劑量/D-時(shí)間/t-效應(yīng)/E”模型，得出具有臨床意義的六味地黃丸給藥方案。

1 儀器與材料

1.1儀器 微透析系統(tǒng)，包括CMA402微透析泵、CMA12Elite PAES微透析探針(膜長(zhǎng)1 mm)和CMA/170微透析樣品收集器3部分，均為瑞典CMA公司生產(chǎn)；XR 205SM DR分析天平(瑞士Precisa公司)。

1.2材料 藥物：六味地黃丸(濃縮丸，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠)。

腎陰虛型糖尿病模型大鼠[3]：選擇大鼠高脂蔗糖飲食聯(lián)合熱應(yīng)激處理造模方法，成年雌性Wistar大鼠，給予主要含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的豬油和50%的蔗糖為食料，造模時(shí)每天被置于干燥球室40球、濕球32球的人工氣候室內(nèi)進(jìn)行熱應(yīng)激3 h處理。

試劑：質(zhì)量濃度為20 g·L-1的戊巴比妥鈉溶液(購(gòu)自Sigma Aldrich公司，批號(hào)69020100)。D-Hanks液(批號(hào)14170-112)，Hanks液(批號(hào)14025-076)，Kreb-hepes緩沖液(批號(hào)15630080)，PBS緩沖液(批號(hào)20012-043)，均購(gòu)自賽默飛世爾公司。質(zhì)量濃度為4 g·L-1的臺(tái)盼藍(lán)(Solarbio公司，批號(hào)T8070)，1%膠原酶Ⅱ型(YEASEN公司，批號(hào)40508ES60)，體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清(Science Cell公司，批號(hào)0500)。100 u·mL-1青霉素(批號(hào)Z130437)和質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的鏈霉素(批號(hào)S66602)，上海源葉生物科技公司。質(zhì)量濃度為0.167 mg·mL-1的LiberaseRI酶溶液(羅氏生物公司，批號(hào)11213865001)，F(xiàn)icoll溶液(南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)SBJ-0155)，5%肝素鈉(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)9041-08-1)。丹皮酚(批號(hào)552-41-0)，馬錢苷(批號(hào)18524-94-2)，莫諾苷(批號(hào)25406-64-8)，芍藥苷(批號(hào)23180-57-6)，均購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司。林格氏液(NaCl 8.5 g，KCl 0.3 g，CaCl20.33 g，ddH2O 1 L)。

2 方法

2.1糖尿病效應(yīng)細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 模型大鼠肝細(xì)胞的分離純化和培養(yǎng)[4-5]：成年雌性Wistar大鼠，腹腔注射質(zhì)量濃度為20 g·L-1的戊巴比妥鈉溶液麻醉(30 mg·kg-1)，200 u肝素鈉溶液。皮膚消毒后，腹部切開U形切口，暴露門靜脈，導(dǎo)管從門靜脈插入2 cm。導(dǎo)管連接到一次性輸血器。后端被連接到輸液瓶，注射用無(wú)鈣和鎂的Hanks液(EDTA 1 mmol·L-1的溶液)200 mL，從下腔靜脈導(dǎo)管注射Hanks液(含有質(zhì)量濃度為0.5 g·L-1的Ⅱ型膠原酶)100 mL,靜滴速率為15 mL·min-1。取出肝臟，置于含Hanks液的平板上，在4 ℃清除肝包膜和血管肝靜脈閉塞，鈍性撕肝組織，并透過多層紗布制成細(xì)胞懸液。濾過200目不銹鋼篩網(wǎng)，以42 g·min-1離心2 min，棄上清液用Hanks溶液，4 ℃離心3次，除去非肝細(xì)胞。通過質(zhì)量濃度為4 g·L-1的臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞活性。分離鈍化的肝細(xì)胞合成培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM)在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，在倒置相差顯微鏡下觀察6 h后的生長(zhǎng)情況。

模型大鼠脂肪細(xì)胞的分離純化和培養(yǎng)[6]：分離大鼠脂肪組織，立即放在Kreb-HEPES緩沖液(KRHB)中，轉(zhuǎn)移到低溫實(shí)驗(yàn)室。在超凈臺(tái)中分離并去除脂肪組織中的白色筋膜和血管，KRHB溶液洗滌3次。切碎脂肪組織，放在含體積分?jǐn)?shù)5%胎牛血清白蛋白的質(zhì)量濃度為10 g·L-1Ⅱ型膠原酶中消化，37 ℃搖床振蕩1 h，100目過濾網(wǎng)篩細(xì)胞，濾液以1 000 r·min-1離心5 min，收集，脂肪細(xì)胞浮在最上面，再加上含有100 u·mL-1青霉素、質(zhì)量濃度為100 mg·mL-1的鏈霉素和體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的完全培養(yǎng)基，6孔板培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。

模型大鼠胰島β細(xì)胞的分離純化和培養(yǎng)[7-8]：成年雌性Wistar大鼠斷脊椎處死，膽總管結(jié)扎至十二指腸。破碎心臟放血，立即用質(zhì)量濃度為0.167 mg·mL-1的LiberaseRI酶溶液通過原位快速原位灌注胰腺膽總管，鈍性解剖分離。把胰腺置于50 mL離心管中，37 ℃水浴，同時(shí)加入適量消化液靜止消化30 min。消化結(jié)束后用Votex振蕩儀劇烈振蕩消化管10 s，終止消化時(shí)加入等量PBS緩沖液保存于4 ℃的PBS緩沖液中。分別用直徑1.0和0.5 mm的不銹鋼濾網(wǎng)過濾消化物，離心，得到糜狀消化終產(chǎn)物；把4 mL質(zhì)量濃度為0.25 g·L-1的Ficoll溶液加入到消化終產(chǎn)物中，渦旋混勻，從下往上逐層加入質(zhì)量濃度為0.11，0.21和0.23 g·L-1的Ficoll溶液各2 mL，形成界面清晰的密度梯度離心溶液。用水平轉(zhuǎn)頭進(jìn)行離心分離，自然加速，零阻力降速，在21%和11%界面分層處吸出細(xì)胞團(tuán)，該細(xì)胞團(tuán)即為純化的胰島β細(xì)胞，雙硫腙特異染色法鑒定胰島β細(xì)胞純度。

2.2微透析取樣技術(shù)的建立 將陰虛糖尿病模型大鼠仰位固定，頸部剪毛備皮，消毒后在大鼠頸部右側(cè)沿頸靜脈方向剪2～3 cm的切口，鈍性分離頸靜脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，并剪一小口，將浸泡在質(zhì)量濃度為50 g·L-1的肝素鈉注射液中20 min以上的血液探針朝右心室方向植入約2.5 cm，并用縫合線固定探針。探針植入24 h后，用含不同質(zhì)量濃度丹皮酚、馬錢苷、莫諾苷和芍藥苷的林格氏液以1.5 μL·min-1的流速灌注探針，平衡1 h后，開始采樣，20 min為取樣間隔，每份樣品20 μL，及時(shí)采用HPLC法直接進(jìn)樣測(cè)定，共3次，計(jì)算探針的相對(duì)回收率，評(píng)價(jià)微透析系統(tǒng)的實(shí)用性和穩(wěn)定性。測(cè)定探針的相對(duì)回收率后，以2 μL·min-1灌注速度灌注PBS緩沖液，洗脫1 h，開始給藥[9]。

2.3效應(yīng)細(xì)胞的篩選 針對(duì)單一細(xì)胞，將40只腎陰虛型糖尿病模型大鼠均分為2組，每組20只，實(shí)驗(yàn)組喂服六味地黃丸5倍等效劑量，對(duì)照組喂服等量生理鹽水，處理24 h，然后用微透析法采集透析液，并用該液處理提取的細(xì)胞，2 h后檢測(cè)葡萄糖濃度，從而檢測(cè)糖尿病模型大鼠制備的肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及胰島β細(xì)胞對(duì)5倍六味地黃丸臨床等效劑量多次給藥所得微透析液的敏感程度。檢測(cè)肝細(xì)胞和脂肪細(xì)胞對(duì)糖代謝的影響[10]，檢測(cè)胰島β細(xì)胞功能的變化[11]。選取藥物反應(yīng)變化幅度最大的細(xì)胞作為糖尿病敏感效應(yīng)細(xì)胞。

2.4給藥模型的建立和驗(yàn)證 各實(shí)驗(yàn)組用20只腎陰虛型糖尿病模型大鼠，選擇6,8和12 h 3個(gè)給藥時(shí)間間隔，各給藥間隔設(shè)置4個(gè)劑量組，分別為0.5,1,1.5和2倍等效劑量，1倍等效劑量為每次0.1 mg，喂藥前和喂藥48 h后分別收集微透析液，用上一步驟選定的胰島β細(xì)胞消化透析液，處理2 h后檢測(cè)葡萄糖濃度，分析濃度變化并給出最優(yōu)給藥方案。

2.5最優(yōu)給藥方案與常規(guī)方案比較 實(shí)驗(yàn)組使用20只腎陰虛型糖尿病模型大鼠，以2.4項(xiàng)下步驟確定的最優(yōu)方案給藥，分別收集給藥后4，8，12，16，24，36，48和72 h的微透析液，處理胰島β細(xì)胞2 h后檢測(cè)葡萄糖濃度；對(duì)照組采用常規(guī)給藥方案，即間隔8 h、1倍等效劑量，同樣收集上述幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的微透析液并處理效應(yīng)細(xì)胞，檢測(cè)葡萄糖濃度。比較檢測(cè)結(jié)果，分析優(yōu)化后的給藥方案是否比常規(guī)方案有優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)果

3.1糖尿病效應(yīng)細(xì)胞的篩選 六味地黃丸多次給藥所得微透析液中既含有血糖又含有藥物成分，故可作為參考指標(biāo)考量細(xì)胞的糖代謝能力，用提取的3種細(xì)胞消化微透析液(服藥24 h后)，2 h后檢測(cè)葡萄糖濃度。結(jié)果表明，3種細(xì)胞處理的含藥微透析液葡萄糖濃度均比服用生理鹽水顯著下降(P<0.01)，但胰島β細(xì)胞相較于肝細(xì)胞和脂肪細(xì)胞更顯著，結(jié)果見表1，故選擇胰島β細(xì)胞為六味地黃丸微透析液的效應(yīng)細(xì)胞。

表13種細(xì)胞對(duì)微透析液敏感程度的差異

Tab.1 Differences in sensitivity of 3 type cells to microdialysate (n=20)

細(xì)胞葡萄糖濃度/mmol·L-1處理前處理后tP肝細(xì)胞10.497±0.39111.508±0.6336.077<0.01脂肪細(xì)胞10.624±0.57011.447±0.3275.601<0.01胰島β細(xì)胞10.153±0.41211.601±0.44510.678<0.01

3.2“藥物劑量/D-時(shí)間/t-效應(yīng)/E”模型的建立 給藥間隔選擇6，8和12 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)；給藥劑量為等效劑量，0.5即為0.5倍等效劑量，1倍等效劑量為0.1 mg；給藥前和給藥后48 h收集透析液。各處理組處理后的葡萄糖濃度均顯著低于處理前(P<0.01)，可以證明六味地黃丸對(duì)腎陰虛型糖尿病有較好的療效，其中給藥間隔12 h，每次1.5倍等效劑量的處理組處理后葡萄糖濃度顯著低于其他組(P<0.05)。故給藥間隔12 h，每次給藥1.5倍等效劑量，即0.15 mg療效最佳，此給藥方案為最優(yōu)方案。見表2。

3.3最優(yōu)給藥方案與常規(guī)給藥方案對(duì)比 結(jié)果顯示，最優(yōu)給藥方案下，葡萄糖濃度36 h即到達(dá)穩(wěn)定值，且下降幅度更大(P<0.05)，而常規(guī)方案需要48 h到達(dá)穩(wěn)定，因此整體治療效果優(yōu)于常規(guī)給藥方案。見表3。

表2給藥間隔-劑量-療效相關(guān)性

Tab.2 Dosage interval-dose-efficacy correlation (n=20)

給藥間隔/h等效劑量/倍葡萄糖濃度/mmol·L-1處理前處理后tP60.511.432±0.3179.611±0.42615.337<0.011.011.497±0.4359.576±0.38114.857<0.011.511.393±0.6019.602±0.44910.676<0.012.011.488±0.4949.645±0.51211.585<0.0180.511.504±0.4719.634±0.47912.449<0.011.011.521±0.6179.412±0.39912.836<0.011.511.379±0.5469.509±0.55410.751<0.012.011.408±0.6359.487±0.37111.681<0.01120.511.537±0.5709.781±0.44510.860<0.011.011.477±0.6639.513±0.39111.411<0.011.511.399±0.4479.334±0.57512.680<0.012.011.534±0.4989.435±0.43913.139<0.01

表3最優(yōu)給藥方案與常規(guī)給藥方案對(duì)比

Tab.3 Comparison between optimal dosing regimen and conventional dosing regimen (n=20)

給藥后時(shí)間/h葡萄糖濃度/mmol·L-1最優(yōu)給藥方案常規(guī)給藥方案tP411.529±0.45211.506±0.4740.1570.876811.243±0.37911.237±0.5010.0430.9661210.862±0.49010.910±0.4350.3280.745169.947±0.53410.271±0.3342.3010.027249.554±0.3989.701±0.4621.0780.288369.391±0.4199.549±0.4181.1940.240489.342±0.5139.422±0.5570.4720.639729.397±0.4669.419±0.3480.1690.867

4 討論

糖尿病在中醫(yī)概念上屬“消渴”。消渴病變分為上、中、下消3種，其中下消(腎虛精虧，即腎陰虛型)為最主要的發(fā)病方式。六味地黃丸重用熟地黃，滋陰補(bǔ)腎，填精益髓，為君藥。山茱萸補(bǔ)養(yǎng)肝腎，并能澀精；山藥補(bǔ)益脾陰，亦能固精，共為臣藥。三藥相配，滋養(yǎng)肝脾腎，稱為“三補(bǔ)”，在臨床上取得了較好的治療效果[12]。微透析取樣法可以做到活體、實(shí)時(shí)取樣分析，在研究藥物動(dòng)力學(xué)、生物代謝等領(lǐng)域有極大的應(yīng)用價(jià)值[13]。此最優(yōu)方案相對(duì)于其他給藥方案在同等治療時(shí)間內(nèi)可以最有效地降低葡萄糖水平，具有臨床推廣的意義。本實(shí)驗(yàn)的不足之處在于處理和檢測(cè)步驟均在體外，不能完全模擬體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境。此外，微透析法需要固定模型大鼠，因此可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)大鼠的生理活性與自由活動(dòng)的大鼠有差異。

六味地黃丸雖然對(duì)腎陰虛型糖尿病有較好的治療效果，但并不適合作為唯一方藥，應(yīng)輔以其他藥物共同治療。