泰萬菌素的抗炎效果分析

文 麗，李仕超（譯）

（上海伊克拜克獸藥銷售有限公司，上海 200333）

0 引言

炎癥的消除對于機體在感染或組織損傷后平衡的恢復至關重要。例如，支原體和胸膜肺炎放線桿菌定植在豬肺中，誘導產生白細胞毒素，裂解中性粒細胞和巨噬細胞。這可以促進自發的炎癥反應，活化的白細胞釋放更多的促炎因子，包括IL-1α，IL-1β， IL-6， CXCL-8 （即IL-8）和白細胞三烯B4。這種自我放大反應正是肺炎病理學特征。

嗜中性粒細胞的凋亡對于炎癥消除必不可少，以質膜出泡、染色體收縮、DNA破碎及凋亡小體的形成為特征。如果清除不徹底，凋亡小體會造成組織器官繼發性壞死。巨噬細胞消除凋亡小體，即胞葬作用，在炎癥的消除中扮演關鍵角色。胞葬作用可以誘導抗炎巨噬細胞表型，降低促炎因子，如IL-6，LBT4，CXCL-8和TNF-α；促進抗炎因子，如TGF-β，LXA4和IL-10。消炎因子包括脂氧素類和消退素類，可以幫助消炎。脂氧素類有抗炎和消炎雙重作用如增強胞葬作用，誘導抗炎因子IL-10的產生，減少致炎因子，起到鎮痛作用。這個脂質介質家族由花生四烯酸通過15-脂氧合酶和15(S)-HETE前體產生。二十二碳六烯酸代謝物如消退素D1（RvD1）是由omega-3和6脂肪酸合成而來。RvD1減少嗜中性粒細胞在肺部聚積，緩解水腫，抑制局部促炎因子的產生。RvD1和它的阿司匹林誘生型差向異構體，在革蘭氏陰性細菌肺炎自我消炎中起關鍵作用。在過去10年里，獸藥和人藥領域的研究者們一直在探索新療法，該種方法通過刺激抗炎或消炎因子來阻止機體的自我延續性炎癥反應。

大環內酯類抗生素有廣泛的免疫調節屬性，它可以在巨噬細胞內聚集，胞內濃度可以比外界高500倍，給予了這些藥物卓越的藥效。關于大環內酯類怎樣改變發炎組織中脂質介質的產生，我們卻知之甚少。為此，我們使用了豬細胞模型和泰萬菌素——一種新型廣譜抗菌藥，是泰樂菌素的衍生物。泰萬菌素是從泰樂菌素經3-乙?；?4異戊酰基修飾后而來的第3代大環內酯類廣譜抗生素（酒石酸乙酰基異戊酰基泰樂菌素）。泰萬菌素現在用于控制雞和豬由支原體等病原引起的呼吸道疾病和腸道細菌感染。最新研究發現，鼠或豬感染豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）后由脂多糖（LPS）引起的肺部炎癥反應模型中，泰萬菌素可以通過抑制NF-κB起到抗炎作用，NF-κB是可以介導促炎因子如CXCL-8（即IL-8）合成的轉錄因子。使用泰萬菌素和豬白細胞作為模型，目前研究表明除了抗菌作用之外，這種抗生素還可以促使嗜中性粒細胞凋亡、起到胞葬作用，抑制促炎因子LTB4的產生，促進LXA4和RvD1的合成。

1 試驗結果

1.1 泰萬菌素誘導豬嗜中性粒細胞濃度和時間依賴性凋亡

Caspase-3裂解，在細胞凋亡中引起DNA斷裂，泰萬菌素處理豬嗜中性粒細胞中明顯高于對照組（圖1）。通過原位末端標記染色法和ELISA檢測法對細胞凋亡產生的單聚和寡聚核苷酸進行檢測，證實了泰萬菌素誘導嗜中性粒細胞的凋亡作用有濃度和時間依賴性（0.5 h和1 h）（圖1）。林可霉素是另外一種豬肺炎的治療用抗生素，不會誘導細胞凋亡。該試驗也檢測了陽性對照staurosporine組對細胞凋亡的誘導作用。

圖1A：凋亡的嗜中性粒細胞末端標記法的熒光圖。

圖1 泰萬菌素誘導豬嗜中性粒細胞的凋亡

綠色是末端標記陽性，藍色是DAPI染色的細胞核。泰萬菌素處理組（1 h， 10 μg/mL）的嗜中性粒細胞末端標記陽性數量（凋亡）更多，1000×放大。

圖1B：1 h處理后末端標記試驗的定量。

數值為末端標記法綠色像素與藍色像素的比值。數值是指平均值±(n=3～6/組) ***P＜0.001（與對照組差異顯著）。

圖1C：ELISA試驗結果顯示細胞凋亡時釋放的單聚和寡聚核苷酸。

數值是指對照組吸光度的倍數變化。數據是各實驗組溶液處理1 h后獲得：對照組（含酚紅的10%胎牛血清），泰萬組、陽性組（staurosporine）、林可霉素組使用不同濃度。數值是指平均值±SEM(n=3～4/組) *P＜0.05。

圖1D：豬嗜中性粒細胞處理0.5 h后，促凋亡的caspase-3相對于β-actin的密度分析。

對照組（含酚紅的10%胎牛血清）、泰萬組（0.1， 1.0或10 μg/mL）、陽性組（10-6mol/L staurosporine）、林可霉素組（11.3×10-6mol/L）。數值是裂解的caspase-3（(17 kDa）相對于β-actin（45 kDa）的條帶密度，表示為與對照組的比率。數值是組平均值±SEM(n=3～6/組). ***P＜0.001（與對照組差異顯著）。

1.2 泰萬菌素誘導豬單核細胞源的巨噬細胞濃度和時間依賴性凋亡

泰萬菌素處理12 h和14 h后也可以誘導豬單核細胞源的巨噬細胞濃度和時間依賴性凋亡， 更早的時間點則不能（圖2）。林可霉素也不能。這個用原位末端標記法、單聚和寡聚核苷酸的產生、裂解caspase-3的超標也得到證實。這些影響在陽性對照組（staurosporine）中也可以看到，林可霉素組不能。

單核細胞源的巨噬細胞用以下溶液處理：對照組（10%胎牛血清培養基）、泰萬組（0.1， 1， 或 10μg/mL）、陽性組（10-6mol/L staurosporine）、林可霉素組（11×10-6mol/L）。

圖2A： 泰萬菌素對巨噬細胞凋亡的誘導作用呈時間和濃度依賴性。

圖2 泰萬菌素時間和濃度依賴性誘導豬巨噬細胞的凋亡

數值是每張圖中末端標記的細胞與核DAPI染色（0.5-24 h）的比值。數值是指平均值(n=4-8/組) *P＜0.05， ***P＜0.001。

圖2B/C： 同樣條件下，凋亡細胞ELISA試驗結果如圖2B（12 h）和圖2C（24 h）所示。

試驗是誘導細胞凋亡后對細胞質中單聚和寡聚核苷酸的定量檢測。數值是指對照組吸光度的倍數。數值是指平均值±SEM (n=3～5/組). *P＜0.05， **P＜0.01。

D/E圖： 泰萬菌素活化豬巨噬細胞中的caspase-3如圖D（12 h）和圖E（24 h）所示。

數值是指平均值±SEM (n=3～5/組). *P＜0.05.

1.3 泰萬菌素不影響豬嗜中性粒細胞和巨噬細胞的壞死

泰萬菌素誘導嗜中性粒細胞凋亡的時間點（0.5 h和1 h，圖1）或誘導巨噬細胞凋亡的時間點（12 h和24 h，圖2），通過乳酸脫氫酶（LDH）釋放的檢測發現，抗生素不會改變這些細胞的壞死（圖3）。

圖3 泰萬菌素在體外對靜息細胞壞死無影響

通過對細胞培養上清液中LDH蛋白的定量來檢測分泌型乳酸脫氫酶（LDH），從而評估細胞壞死。豬嗜中性粒細胞用以下溶液孵育：對照組（含酚紅的10%胎牛血清）、泰萬組（10μg/mL）、林可霉素組（11×10-6mol/L，等摩爾數）、陽性對照組（1% Triton X-100）圖3 A（0.5 h）和圖3B（1 h）：數值是指對照組的倍數，數值是指平均值 ± SEM (n = 9)， **P＜0.01。圖3C ：豬巨噬細胞的細胞壞死（通過LDH的釋放來檢測）。

分別用以下溶液孵育0.5-24 h：對照組（10%胎牛血清培養基）、泰萬組（0.1， 1.0或 10 μg/mL）、陽性對照組（1% Triton X-100）。數值是指對照組的倍數，對照組與泰萬組之間數值差異不大（n=6～9/組），數值是指平均值 ± SEM，*P＜ 0.05。

1.4 泰萬菌素通過巨噬細胞促進嗜中性粒細胞的胞葬作用，不會改變吞噬作用

為了檢測泰萬菌素誘導嗜中性粒細胞的凋亡是否導致胞葬作用，豬嗜中性粒細胞用泰萬菌素（0.1， 1.0或10 μg/mL）或上述對照組溶液孵育0.5 h，再與單核細胞源的巨噬細胞共同孵育2 h。泰萬菌素濃度依賴性顯著增加胞葬作用（圖4A）。誘導巨噬細胞的胞葬作用與巨噬細胞吞噬作用之間沒有關聯（通過酵母聚糖顆粒的吸收檢測），表明在凋亡小體中，泰萬菌素誘導的巨噬細胞攝入底物的激活作用至少是在一定程度上是有選擇性的（圖4B）。

圖4A：過氧化物酶（MPO）是中性粒細胞的標記物。

在嗜中性粒細胞用泰萬菌素（0.1， 1， 10 μg/mL）處理0.5 h后的巨噬細胞中發現MPO的濃度增加。未處理的嗜中性粒細胞處理2 h（10% FBS 0.5 h）處理的豬巨噬細胞作為對照。

數值用對照組MPO活性測量值的倍數表示，數值是平均值±SEM (n=3/組). ***P＜0.001.

圖4B：酵母聚糖顆粒的甘露糖依賴性吞噬作用在豬巨噬細胞中沒有變化，2 h時胞葬作用增強。

單核細胞源的巨噬細胞用1 mg/mL的酵母聚糖顆粒孵育2 h (n=6/組)，對照組10% FBS，泰萬組10μg/mL泰萬菌素孵育2 h。含有一個或多個酵母聚糖的巨噬細胞計數為陽性細胞，數值是陽性巨噬細胞與總數的比值，數值為平均值±SEM。

圖4 泰萬菌素促進胞葬作用，但在豬體外單核細胞源巨噬細胞中不調節甘露糖依賴性的吞噬作用

1.5 泰萬菌素抑制嗜中性粒細胞中促炎因子LTB4的產生

通過超高溫液相色譜質譜法（UHPLC-MS）檢測發現，泰萬菌素抑制鈣離子通道活化的嗜中性粒細胞中LTB4的產生（圖5）。鈣離子通道的活化反應使嗜中性粒細胞高度活化，隨后升高的LTB4，是在發炎組織中合成。

圖5A：通過反相-高效液相色譜法（RP-HPLC）檢測豬始嗜中性粒細胞中的促炎因子LTB4分泌水平。

對照組用 10% HI-FBS in HBSS處理，試驗組10 μg/mL泰萬菌素、加或不加3μM 鈣離子載體 A23187 ，0.5 h。數值代表LTB4峰面積的倍數，數值是平均值±SEM (n=7～10/組).**P＜0.01（與對照組）； #P＜ 0.05（3 μM A23187）。

圖5B：豬嗜中性粒細胞用以下處理0.5 h后，檢測LTB4水平。通過液相色譜質譜法（LC-MS），數值代表LTB4濃度，數值是平均值±SEM (n=10～15/ 組). ***P＜0.001（與對照組）； ##P＜ 0.01（3 μM A23187）。

1.6 泰萬菌素LPS刺激的巨噬細胞中抑制促炎因子CXCL-8和IL-1α的釋放

相對于對照組，泰萬菌素處理組中，LPS刺激的巨噬細胞產生的CXCL-8（圖6A）和IL-1α（圖6B）明顯更低。

（圖6B）明顯更低。在有或無LPS（1 μg/mL）處理2 h前提下，珠狀熒光復合系統被用于評估對照組或泰萬菌素（10 μg/mL）處理組的豬巨噬細胞CXCL-8和IL-1α水平。

豬巨噬細胞用10% HI-FBS或10 μg/mL泰萬菌素，在有或無LPS（1 μg/mL）條件下處理2 h后收集上清液，用于分泌型趨化因子/細胞因子的檢測。使用珠狀熒光試驗和標準曲線，檢測了分泌蛋白量，數值單位 pg/mL。

圖5 泰萬菌素抑制鈣離子通道活化的嗜中性粒細胞中促炎因子LTB4的產生

圖6 泰萬菌素處理抑制CXCL-8和IL-1α在LPS刺激的巨噬細胞中的分泌

在LPS刺激的巨噬細胞中，CXCL-8（圖6A）和IL-1α（圖6B）的蛋白分泌受到泰萬菌素抑制。數值代表平均值±SEM (n=3～4/組). *P＜0.05， **P＜ 0.01（未刺激組）； #P＜0.05 （LPS刺激的巨噬細胞）。

1.7 泰萬菌素促進嗜中性粒細胞中消炎因子LXA4和RvD1的釋放

使用液相色譜/質譜法（LC/MC）評估豬嗜中性粒細胞(經對照組溶液或泰萬菌素孵育)LXA4和其前體15S- HETE，以及RvD1的產生。泰萬菌素促進LXA4（圖7A）和RvD1（圖7C）的釋放。15S- HETE的產生值，未達到具有統計學意義的水平（圖7B）。

用10% HI-FBS或10μg/mL泰萬菌素處理0.5 h，用LC/MC檢測：LXA4的分泌水平（圖7A）；

前體15S-HETE的分泌水平（圖7B）；RvD1的分泌水平（圖7C）。數值分別通過與相應物質洗脫峰面積標準曲線計算得來。數值代表平均值±SEM (n=18～20). *P＜0.05， ***P＜0.01 （未刺激對照）。

1.8 泰萬菌素在嗜中性粒細胞中上調胞漿型磷脂酶A2（cPLA2）和磷脂酶C（PLC）的活性

為了更進一步探究泰萬菌素對嗜中性粒細胞脂質調節介質影響的機制，又進行試驗對胞漿型磷脂酶A2和磷脂酶C（PLC）的活性進行了評估。cPLA2可以從膜磷脂釋放花生四烯酸，花生四烯酸可以由甘油二酯脂肪酶代謝產生，三磷酸肌酐可以由膜磷脂PLC產生。這種花生四烯酸的形成可以從釋放的花生四烯酸中合成脂質介質。與對照組相比，在泰萬菌素孵育的豬嗜中性粒細胞中，胞漿型磷脂酶A2（cPLA2）和磷脂酶C（PLC）的活性顯著提高（圖8）。

圖8A：胞漿型磷脂酶A2（cPLA2）活性在泰萬處理組（10 μg/mL，0.5 h）和對照組（10% HI-FBS）無差異。數值代表 cPLA2活性（μmol/min/mL），數值代表平均值± SEM (n=5/組). *P＞0.05.

圖7 泰萬菌素促進消炎因子LXA4和RvD1的分泌

圖8 泰萬菌素在豬嗜中性粒細胞中促進細胞內磷脂酶PLC活性

圖8B：泰萬處理組（10 μg/mL ，0.5 h）胞內磷脂酶PLC活性顯著高于對照（HBSS中10% HI-FBS）。數值代表PLC酶活性，是對照組的倍數。數值代表平均值±SEM (n=4/組). *P＜0.05.

2 討論

細菌感染治療中，若提供抗菌和抗炎/消炎雙重效果，可產生優良的臨床效益。該研究使用泰萬菌素在豬嗜中性粒細胞和巨噬細胞中誘導免疫調節這一模型，展示了一種新型的抗生素誘導嗜中性粒細胞釋放有效的消炎因子RvD1和 LXA4，這種作用與PLC活性有關。研究發現泰萬菌素可以抑制促炎因子的產生，如嗜中性粒細胞中的LTB4和LPS刺激的巨噬細胞中的CXCL-8和IL-1α。最終泰萬菌素在嗜中性粒細胞和單核細胞源的巨噬細胞中誘導濃度和時間依賴性凋亡，促進胞葬作用。至少在林可霉素（另一種豬肺炎的輪換治療藥物）沒有這種作用?？傊?，這項研究表明泰萬菌素，除了其抗菌活性以外，還有顯著的免疫調節特性，為體內治療炎癥提供了極大可能性，有待進一步研究。豬細菌性肺炎中的病理變化和急劇的器官損傷，至少可以減少局部細胞壞死和嗜中性粒細胞的自我放大作用，這和動物、人類多種炎性疾病類似。這些垂死細胞的控制，通過凋亡和胞葬作用的清除，代表了炎癥消除的關鍵階段。在機體平衡條件下，嗜中性粒細胞是沒有活性的，通過凋亡（細胞程序性死亡）在炎癥位點被移除。在細胞凋亡過程中，在細胞質膜完整性存在的情況下，細胞器被摧毀，從而阻止促炎因子和組織溶解復合物釋放到周圍環境中。由此而論，白細胞凋亡的促進作用被認為賦予了藥物顯著的消炎屬性，這種生理調控程序不影響其抗菌功能。近期有研究發現，細胞周期蛋白依賴的激酶抑制劑與大環內酯類抗生素，如替米考星和托拉霉素一樣，通過誘導嗜中性粒細胞凋亡來增強消炎作用。與之一致，該研究也是基于抗生素促進炎癥細胞凋亡的設想，其可能對于宿主炎癥為主要發病機制的傳染性疾病中有重要治療效果。近期研究表明：泰萬菌素在鼠科急劇肺損傷模型中，以及在用豬藍耳病毒攻毒的豬只中通過抑制NF-κB途徑的激活，起到免疫調節作用。這些研究可能指向與白細胞內高親嗜性利用這種復合物相關的胞內機制。類似于這種設想，托拉霉素及其他大環內酯類抗生素的胞內聚積可能抑制胞內磷脂酶（調控脂質介質合成和磷脂依賴性細胞凋亡），泰萬菌素確實可以降低磷脂酶A2的表達。與之對應，這項研究表明，在豬嗜中性粒細胞中，泰萬菌素可能增加細胞質內PLC和磷脂酶A2。這種矛盾是否反應了不同模型中不同的生物功能，還有待進一步研究。

除了抗菌效果之外，大環內酯類抗生素可能調節宿主白細胞反應，引起血管生成作用和抗癌作用。與這些結果類似，該研究報道了泰萬菌素抑制巨噬細胞中的促炎因子IL-1α和趨化因子CXCL-8。關于這些藥物是如何影響脂質介質的產生，目前還知之甚少。LTB4和CXCL-8一樣是與肺炎發病有關的強大的中性粒細胞趨化因子。LTB4還與嗜中性粒細胞脫粒、超氧化物自由基和彈性蛋白酶的局部釋放有關，與β-整合素一起，引起黏膜群集表型，并進一步維持白細胞招募和炎性損傷。該研究證實泰萬菌素除了抗菌活性以外，還可以直接抑制LTB4從激活的豬嗜中性粒細胞中釋放。

該研究通過超高效液相色譜-質譜法（UHPLCMS），鑒定了一種新型抗生素的效果——觸發產生有效的消炎脂質代謝物RvD1和LXA4。近期報道了托拉霉素可以通過豬嗜中性粒細胞促進LXA4的產生。通過不斷進行的有關LXA4用于人類齒齦炎治療、Ⅱ型糖尿病、動脈粥樣硬化和哮喘臨床試驗，這些消炎脂質介質的臨床意義正在不斷得到人們重視。此外，鑒于LTB4的同時抑制作用，泰萬菌素可以為研究抗生素誘導的脂質介質類型轉換提供有力的武器，對于炎癥的消除至關重要。胞葬作用確實促進脂質介質類型轉換。在這個過程中，嗜中性粒細胞在前列腺素E2和D2的作用下，基因表達水平上發生變化，通過增加15-脂氧合酶的表達，產生脂氧素和D類消退素，從而開啟花生四烯酸的代謝。泰萬菌素是否可以改變脂質介質類型轉換相關酶的轉錄，或者泰萬菌素是否作用于變構位點來實現這些酶的抑制或刺激，還有待進一步研究。該研究尚且是體外試驗，還需要豬只活體感染模型來證實泰萬菌素的這種作用，有可能為大環內酯類抗生素乃至其他藥物的新促分辨特征鋪平道路。這些在抗生素耐藥性的環境中會發揮什么作用，也是未來研究的一個重要方向。