微波預處理對熱誘導小麥面筋蛋白凝膠性質和微觀結構的影響

陸 毅 穆冬冬 羅水忠 趙妍嫣 鐘昔陽 姜紹通 鄭 志

(合肥工業大學食品科學與工程學院;安徽省農產品精深加工重點實驗室，合肥 230009)

小麥面筋蛋白又稱谷朊粉，是小麥淀粉加工過程副產物，蛋白質質量分數為72%～85%，氨基酸組成豐富[1]。小麥面筋蛋白作為一種優質的蛋白質資源，被廣泛應用于食品、飼料等領域。由于小麥面筋蛋白具有良好的延展性、黏彈性、乳化性和吸水性等功能性質，可被用于制作可食性、易降解薄膜[2]、添加到化妝品[3]、寵物飼料中[4]，又由于其良好的凝膠特性，常被作為添加劑加入到面包等烘焙制品、肉丸等肉制品中來改善產品的感官特性和質構。

蛋白質膠凝作用是變性蛋白質分子聚集而形成有序的蛋白質網絡結構的過程。熱誘導凝膠是指蛋白質受熱變性，蛋白質結構發生一定程度的展開，變性后的蛋白質聚集形成大分子的聚集體，最終產生強度較高且富有彈性的凝膠[5]。但是小麥面筋蛋白緊密的分子結構和較差的親水性限制了其凝膠性能的提高和穩定。提高蛋白質凝膠性的方法主要包括：物理、化學、酶及復合改性等。物理方法由于其操作的簡便性和安全性引起了許多研究者注意。微波處理作為一種物理改性方法，通過熱能量的變化來改變蛋白質的高級結構和分子間的聚集方式，從而改善蛋白質的功能特性，成為近年研究熱點[6]。Liu等[7]研究發現，相比單純的水浴加熱制備熱誘導大豆分離蛋白凝膠，微波預處理顯著提高了熱誘導大豆分離蛋白凝膠的彈性模量，并且微觀結構呈現更為致密的蜂窩狀。Qin等[8]在微波預處理對谷氨酰胺轉氨酶(TG酶)促大豆蛋白與小麥面筋蛋白混合凝膠特性影響的研究中發現，一定程度的微波預處理導致了蛋白分子結構的松散，促進了TG酶的交聯效率，使其形成了更為致密的凝膠網絡結構，從而顯著提高了混合蛋白凝膠的彈性模量、凝膠強度和持水性等性質。

本研究擬通過分析微波預處理下熱誘導小麥面筋蛋白凝膠的強度、持水性、水分分布、表面疏水性、分子間作用力和微觀結構的變化，探究微波預處理對熱誘導小麥面筋蛋白凝膠性質的影響，為改善小麥面筋蛋白凝膠的性質及其應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥面筋蛋白：安徽瑞福祥食品有限公司；考馬斯亮藍G250；8-苯胺-1-萘磺酸：北京索萊寶科技有限公司；牛血清蛋白：上海緣聚生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

WP700TL23-K1型微波儀，格蘭仕微波爐電器有限公司；CR22GⅡ型冷凍離心機，日本HITACHI公司；TA-XT2i型質構儀、Q200-2156型差示掃描量熱儀(DSC)，美國TA儀器公司；FD-1B-50型冷凍干燥機，北京博醫康儀器有限公司；MX-S渦旋混合器，美國Scilogex公司；MultiskanTMFC型全波長酶標儀，Thermo Fisher Scientific公司；721G型分光光度計，上海精科儀器有限公司；JSM-6490LV型掃描電子顯微鏡(SEM)，日本電子公司。

1.3 小麥面筋蛋白的微波預處理和熱誘導小麥面筋蛋白凝膠的制備

參考Wang[9]等的方法略做修改，蒸餾水配制25 mL、16%小麥面筋蛋白懸浮液，將制備好的懸浮液置于帶有功率和時間控制器的微波儀中，分別在70、210、350、490、700 W微波功率，90 s微波處理時間；10、30、50、70、90 s微波處理時間，700 W微波功率的條件下處理懸浮液。將懸浮液95 ℃水浴加熱40 min，冰水浴冷卻30 min，獲得熱誘導凝膠置于4 ℃冰箱待測。為防止水蒸氣破壞凝膠結構，采用間歇式加熱，每加熱20 s停頓10 s。以未經微波預處理的小麥面筋蛋白懸浮液經過單純的熱誘導小麥面筋蛋白凝膠作為對照組。

1.4 檢測方法

1.4.1 凝膠強度的測定

參考孫撬撬等[10]的方法，取1.3制備的熱誘導小麥面筋蛋白凝膠，采用質構儀測定樣品凝膠強度。

1.4.2 持水性的測定

參考梁婧等[11]的方法，略作修改。取3 g(記作Wt)1.3制備的凝膠樣品于4 ℃，8 000 r/min條件下離心15 min。將離心后的樣品轉移到濾紙上除去水分，再次稱重(記作Wr)。持水性計算公式：

式中：Wt為離心前凝膠樣品的質量；Wr為離心并除去溢出的水分后凝膠的質量。

1.4.3 水分分布的測定

根據王飛鏑等[12]的方法略作修改，取3～5 mg凝膠樣品于鋁盤中壓盤，以空盤為對照組。將樣品置于Q200示差量熱掃描儀中，以5 ℃/min的速度從-60 ℃升溫到50 ℃，氮氣流速50 mL/min。計算公式：

凝膠樣品中非凍結水含量：Wnf=Wt-Wf

式中：Wt為凝膠總含水量；Wf為凝膠中可凍結水含量；ΔH為凝膠中水的熱焓值/J/g；ΔH0為純水的熱焓值，334 J/g。

1.4.4 表面疏水性的測定

小麥面筋蛋白凝膠的表面疏水性H0參考Wang等[13]的方法測定。取0.1 g冷凍干燥后的凝膠樣品溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0，15 mL)，8 000 r/min離心15 min后取上清液，上清液蛋白濃度由考馬斯亮藍法測得。將上清液分別稀釋為0.15、0.075、0.038、0.019 mg/mL。取3 mL上清液，加入30μl ANS后測量熒光強度(激發波長：365 nm，發射波長：484 nm)。H0為熒光強度相對蛋白質濃度的初始斜率值。

1.4.5 分子間作用力的測定

根據Cao等[14]的方法稍作修改。用于溶解熱誘導小麥面筋蛋白凝膠樣品的四種磷酸鹽緩沖溶液如下：0.05 moL/L NaCl (PA)；0.6 moL/L NaCl (PB)；0.6 moL/L NaCl+1.5 moL/L尿素 (PC)；0.6 moL/L NaCl+8 moL/L尿素 (PD)。取0.3 g冷凍干燥的凝膠樣品，分別溶于5 mL四種磷酸鹽緩沖溶液中。4 ℃條件下靜置1 h后，8 000 r/min離心20 min取上清液，以考馬斯亮藍法測上清液蛋白濃度。溶解于PB和PA中的小麥面筋蛋白含量之差代表離子鍵的貢獻，溶解于PC和PB中的小麥面筋蛋白含量之差代表氫鍵的貢獻，溶解于PD和PC中的小麥面筋蛋白含量之差代表疏水相互作用的貢獻。

1.4.6 微觀結構的觀察

參考謝新華等[15]的方法，采用掃描電子顯微鏡觀察熱誘導小麥面筋蛋白凝膠的微觀結構。

1.5 數據處理與分析

本研究中每個試驗重復三次，結果采用平均值±標準差的形式表示。采用SPASS軟件分析數據的顯著性(P<0.05)，采用Origin8.0軟件制作圖片。

2 結果與分析

2.1 熱誘導小麥面筋蛋白凝膠強度的分析

凝膠強度是熱誘導小麥面筋蛋白凝膠性質的一個重要指標。熱誘導小麥面筋蛋白凝膠強度的變化如圖1所示。

由圖1可知，隨著微波功率的增大，凝膠強度呈現出先減小后增大的趨勢。700 W微波功率時凝膠強度達到158.6 g/cm2，顯著高于對照組的凝膠強度。微波時間對凝膠強度的影響也表現出相似的趨勢。葉陽等[16]在微波預處理對雞蛋清蛋白凝膠強度影響的研究中得到了類似的結果，認為凝膠強度的增大是由于微波預處理使得小麥面筋蛋白結構松散，導致埋藏在分子內部的疏水性基團的暴露，進而增強了凝膠形成過程中蛋白分子間的疏水相互作用，促進了更為穩定的蛋白凝膠的形成。

圖1 微波預處理對小麥面筋蛋白凝膠強度的影響

2.2 熱誘導小麥面筋蛋白凝膠持水性的分析

小麥面筋蛋白凝膠持水性反映了凝膠截留水分的能力，熱誘導小麥面筋蛋白凝膠持水性的變化情況如圖2所示。

圖2 微波預處理對小麥面筋蛋白凝膠持水性的影響

由圖2可知，當微波時間為90 s時，隨著微波功率的增加，凝膠持水性略微降低，在210 W時降至29.26%，隨著功率的進一步增加，凝膠持水性顯著增加。在700 W功率條件下，熱誘導小麥面筋蛋白凝膠持水性的變化表現出逐漸增大的趨勢。在700 W，90 s條件下，持水性達到83.13%。結果表明了一定程度的微波預處理能夠促進蛋白質-水之間的相互作用，使得更多的水分保留。李秋慧等[17]在微波處理對大豆-磷脂混合凝膠體系影響的研究中也得到了類似的結果，發現隨著微波功率的增加，復合凝膠體系的WHC呈現逐漸增大的趨勢。可能的原因是一定程度的微波預處理改變了蛋白質分子的構象，促進了更為致密均勻的凝膠網絡的形成，致密、均勻的凝膠網絡能夠將更多的水分束縛在凝膠體系中，從而增強了凝膠的持水能力。

2.3 熱誘導小麥面筋蛋白凝膠中水分分布的分析

通過熱分析法(DSC)研究小麥面筋蛋白凝膠體系中水分的分布，熱誘導小麥面筋蛋白凝膠體系中水分分布的變化如圖3所示。

圖3 微波處理對小麥面筋蛋白凝膠水分分布的影響

凝膠體系中水分分布是凝膠性質的重要影響因素，其中蛋白質-水之間相互作用對維持凝膠三維網絡結構具有重要作用[18],由圖3可知，熱誘導小麥面筋蛋白凝膠體系中總含水量的變化不顯著，而當微波功率和微波時間增大時，體系中的非凍結水含量呈現出顯著增大的趨勢。在微波功率700 W，微波時間90 s條件下，非凍結水含量達到25.20%。因此認為一定條件下的微波預處理能夠有效增強小麥面筋蛋白與水分子間的相互作用。“三態水”理論認為，凝膠體系中的水分為非凍結水和凍結水兩大類[19]。Hayashi等[20]采用DSC，通過測定可凍結水含量分析了大豆分離蛋白中的水分分布情況，發現非凍結水與蛋白質分子緊密連接在一起。Chen[21]等的研究表明，水分子與蛋白質分子以非凍結水的形式緊密結合是導致體系具有較高持水性能的重要因素之一。

2.4 熱誘導小麥面筋蛋白凝膠表面疏水性的分析

表面疏水性反映了蛋白質表面疏水性基團的數量，對極性條件下的蛋白質的穩定性、構象中起著重要作用，對表面疏水性的分析能夠用來反映蛋白質構象的變化[18]。熱誘導小麥面筋蛋白凝膠表面疏水性的變化如圖4所示。

圖4 微波預處理對小麥面筋蛋白凝膠表面疏水性的影響

當微波時間為90 s時，微波功率在70 W的條件下相比對照組的表面疏水性增加，而隨著微波功率從70 W增加到700 W時，表面疏水性逐漸降低。當微波功率700 W時，微波時間在10 s的條件下表面疏水性相比對照組的表面疏水性有所增強，而隨著微波時間的增加，表面疏水性逐漸降低至62.73。蔡建榮等[22]認為微波能夠誘導蛋白分子產生空間極化現象，破壞維持蛋白質空間結構的非共價鍵，使其部分展開，導致疏水性基團暴露，表面疏水性增加。隨著微波功率和時間的增加，極化的蛋白質之間通過疏水相互作用，靜電相互作用、氫鍵等非共價鍵使小麥面筋蛋白發生聚集，疏水基團被重新埋藏起來，表面疏水性減弱。

2.5 熱誘導小麥面筋蛋白凝膠分子間作用力的分析

離子鍵、氫鍵、疏水相互作用等化學鍵是維持小麥蛋白凝膠結構的主要作用力。根據不同化學試劑能夠破壞小麥面筋蛋白凝膠特定的化學鍵，測定熱誘導小麥面筋蛋白凝膠中分子間作用力的變化。

圖5 微波處理對小麥面筋蛋白凝膠分子間作用力的影響

如圖5所示，微波預處理后，氫鍵的貢獻相比對照組表現出了明顯的降低，這可能是由于微波熱效應破壞了部分維持蛋白質結構的氫鍵，而在冷卻階段形成的氫鍵較少[9]。在微波功率210 W，處理時間90 s和微波功率700 W，處理時間30 s時，凝膠中疏水相互作用的貢獻分別為0.65 g/L和0.78 g/L，顯著低于對照組的0.85 g/L。隨著微波作用的加強，疏水相互作用增加至1.69 g/L。有研究報道[15, 23-24]，在蛋白凝膠形成過程中疏水相互作用是維持蛋白質凝膠結構的主要作用力之一，而增強的作用力有利于凝膠形成致密、穩定的網絡結構。

2.6 熱誘導小麥面筋蛋白微觀結構的分析

SEM的測定評估了微波預處理對小麥面筋蛋白凝膠三維網絡結構的影響。熱誘導小麥面筋蛋白凝膠微觀結構的變化如圖6所示。

注：a:對照組；b、c、d、e、f、:微波功率700 W，微波時間10、30、50、70、90 s預處理后小麥面筋蛋白凝膠。圖6 微波預處理對小麥面筋蛋白凝膠微觀結構的影響

由圖6可知，對照組的微觀網絡結構呈圓孔網絡狀，孔隙較大且粗糙。而經過微波預處理的熱誘導小麥面筋蛋白凝膠則具有更為致密、平滑和均勻的三維網絡結構。Ji等[25]在微波預處理對鱈魚魚糜-魔芋膠混合凝膠性質影響的研究中發現，鱈魚魚糜和魔芋膠經過微波預處理后形成了網絡結構更為致密、均勻的混合凝膠。凝膠的三維網絡結構是其持水性等凝膠性質的重要影響因素。Chen[26]等的研究認為致密均勻的網絡結構能夠將水分更好的束縛在凝膠體系中，進而改善其持水性等凝膠性質。因此可以認為適當的微波預處理能夠有效改善熱誘導小麥面筋蛋白凝膠的三維網絡結構。

3 結論

微波預處理通過誘導小麥面筋蛋白發生空間極化現象及分子結構的部分展開，能夠顯著增大熱誘導小麥面筋蛋白凝膠的凝膠強度和持水性，分別比對照組提高83.4%和162%，表面疏水性降低至62.73；當微波功率為700 W，微波時間90 s時，疏水相互作用貢獻增加，并促使了孔隙更為致密、均勻的熱誘導小麥面筋蛋白凝膠三維網絡的形成。因此可認為微波預處理能夠有效地改善熱誘導小麥面筋蛋白凝膠的性質和微觀結構，可以為改善小麥面筋蛋白凝膠的性質及其在食品工業的應用提供新思路。