擬微綠球藻粉對大菱鲆幼魚生理和脂肪酸組成的影響

胡冬雪，馬 季，張 燕，王曉艷，喬洪金，王際英，李寶山，孫永智

( 1.上海海洋大學，水產科學國家級實驗教學示范中心，農業農村部魚類營養與環境生態研究中心，水產動物遺傳育種中心上海市協同創新中心，上海 201306； 2.山東省海洋資源與環境研究院，山東省海洋生態修復重點實驗室，山東 煙臺 264006 )

隨著全球漁業捕撈量的減少和水產養殖業的大規模擴張，魚油的價格快速上升，飼料成本也隨之增加，尋找替代魚油的新型飼料原料已是水產飼料行業亟需解決的問題之一。目前常用的替代原料有動物油脂和植物油，尤其是植物油，以其價格低廉和來源廣泛被用作主要的魚油替代原料[1]，在多種魚類飼料中進行了魚油替代研究[2-4]，而多數養殖魚類特別是海水魚類以高不飽和脂肪酸為必需營養素，因此植物油并非理想的魚油替代原料，此外，植物油中還含有高水平的抗營養因子[5-7]，對于魚類的營養也是不利的。

魚體內的高不飽和脂肪酸主要經食物鏈傳遞，來源于微藻，擬微綠球藻(Nannochloropsis)的脂肪酸組成和魚油類似，含有二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸等魚類必需的n-3高不飽和脂肪酸[8]，且含有豐富的天然色素如玉米黃素和蝦青素，可以增強免疫能力和抗氧化能力，提高魚蝦蟹苗種的發育和存活率[9-10]，同時又因為擬微綠球藻具有繁殖迅速、適溫范圍廣、對pH適應性較強、易培養等特點，可利用電廠煙道氣進行規模化培養，未來有作為飼料原料的潛力[11]。最近規模化生產的微藻已用于生物燃料和人體營養補充劑，持續研究有可能獲得更廣泛的市場和更低的成本[12-13]。前期研究表明，用微藻替代水產飼料中的魚油，在適宜的替代水平范圍內對水產動物無負面影響。Qiao等[14]研究發現，飼料中添加裂壺藻(Schizochytrium)、擬微綠球藻與大豆油的混合物替代褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)幼魚飼料中的魚油，對褐牙鲆幼魚的飼料效率、生長性能和脂肪酸組成無顯著影響；王慶超[15]研究發現，飼料中添加亞麻油和適量的裂壺藻替代大菱鲆(Scophthalmusmaximus)幼魚飼料中的魚油，可使魚體肌肉脂肪酸組成發生改變，大菱鲆幼魚的二十二碳六烯酸含量顯著升高；李紅艷等[16]研究發現，大菱鲆幼魚飼料中滸苔(Enteromorphaprolifera)添加量為5%時，其飼喂效果較好。類似的結果在花鱸(Lateolabraxjaponicus)[17]、金頭鯛(Sparusaurata)仔稚魚[18-19]、大西洋鮭(Salmosalar)幼魚[20]等研究中均有發現。

大菱鲆是世界上公認的優質比目魚之一，內臟團小，出肉率高，肌肉豐厚白嫩，味道鮮美，營養豐富，是我國北方主要的養殖經濟魚類，其商品化飼料高度依賴魚粉和魚油，是進行魚油替代的理想魚種。因此本試驗旨在探究飼料中添加擬微綠球藻粉替代魚油對大菱鲆幼魚血清生化指標、體組成和脂肪酸組成的影響，以期為微藻在水產飼料中的實際應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

以大豆濃縮蛋白和白魚粉為主要蛋白源，以擬微綠球藻粉等梯度替代大菱鲆幼魚飼料中的魚油，分別替代基礎飼料中0(對照組)、8%、16%、24%和32%的魚油，配制5種等氮等能的試驗飼料。飼料配方、營養組成和脂肪酸組成見表1、表2。

1.2 飼料制作

所有飼料原料粉碎過80目篩，按照飼料配方稱量質量后由小到大逐級定量均勻混合，隨后加入適量的蒸餾水和魚油二次均勻混合，擠壓制成5 mm粒徑的飼料，60 ℃烘干后，于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3 飼養管理及樣品采集

養殖試驗在山東省海洋資源與環境研究院養殖實驗室進行，為期37 d，采用全封閉水循環系統。試驗魚購自蓬萊宗哲養殖場，種質來源相同、規格均勻、健康無病，平均體質量(82.64±0.32) g。正式試驗前，大菱鲆幼魚在養殖系統中馴養2周，期間投喂對照組飼料，然后隨機分為5組，每組設3個重復，每個重復25尾魚，放養于直徑80 cm、高70 cm、水深約50 cm的綠色圓柱形養殖桶中，每種飼料隨機投喂3個桶。每日定時定量投喂2次(8:00，15:30)，投喂量為魚體質量的1%～2%，根據攝食情況調整投喂量，投喂結束約30 min排殘餌，統計并計算殘餌量。養殖過程水溫控制在(15.9±0.5) ℃，pH 7.8～8.2，鹽度28～30，溶解氧>5 mg/L，氨氮、亞硝酸氮均<0.1 mg/L。

養殖試驗結束后，禁食24 h，隨機取3尾用于全魚體組成常規分析，剩下隨機取10尾靜脈取血，隨后的試驗魚分離內臟、肝臟和背肌，背肌和肝臟-20 ℃保存，用于常規分析。以上取樣均在冰盒上進行，血樣在4 ℃冰箱靜置4 h，4000 r/min，離心10 min，取上清液，-80 ℃保存，用于測定血清生理生化指標。

1.4 測定指標和方法

飼料及組織樣品中，水分采用105 ℃烘干恒等質量法測定(GB/T 6435—2006)；粗蛋白采用凱氏定氮法測定(GB/T 6432—2006)；飼料中粗脂肪和組織樣品的粗脂肪采用索氏抽提法測定(GB/T 6433—2006)；粗灰分采用馬弗爐550 ℃灼燒法測定(GB/T 6438—2007)；能量采用燃燒法測定(C6000，IKA，德國)。

表1 飼料配方及營養組成(干物質基礎) %

注：a.白魚粉(干物質)：粗蛋白含量65.47%，粗脂肪含量7.20%. b.大豆濃縮蛋白(干物質):粗蛋白含量69.85%，粗脂肪含量2.10%. c.礦物質預混料(mg/kg)：MgSO4·7H2O, 3568.0; NaH2PO4·2H2O, 25 568.0; KCl, 3020.5; KAl(SO4)2, 8.3; CoCl2, 28.0; ZnSO4·7H2O, 353.0; CaCO3, 15 968.0; CuSO4·5H2O, 9.0; KI, 7.0; MnSO4·4H2O, 63.1; Na2SeO3, 1.5; C6H5O7Fe·5H2O,1533.0; NaCl, 100.0 mg; NaF, 4.0. d.維生素預混料(mg/kg)：維生素A, 38.0; 維生素D, 13.2; α-生育酚, 210.0; 硫胺素, 115.0; 核黃素, 380.0; 鹽酸吡哆醇, 88.0; 泛酸, 368.0; 煙酸, 1030.0; 生物素, 10.0; 葉酸, 20.0; 維生素B12, 1.3; 肌醇, 4000.0; 抗壞血酸, 500.0. e.擬微綠球藻粉(干物質)：粗蛋白50.72%, 粗脂肪18.05%, 購自煙臺海融生物技術有限公司.

表2 試驗飼料脂肪酸組成 %

血清中高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯、膽固醇采用全自動生化分析儀(7020，日立，日本)進行測定。血清總超氧化物歧化酶、總抗氧化能力和溶菌酶均采用南京建成的試劑盒測定。

1.5 樣品中脂肪酸分析

脂肪酸測定方法參照文獻[21]的方法并稍作改進。肌肉和肝臟樣品真空冷凍干燥48 h后，磨成粉末，稱取約0.1 g的樣品放入50 mL螺口試管中，加入內標0.5 mL，甲醇鹽酸3 mL，正己烷1 mL，封口后輕輕振蕩，70 ℃金屬浴甲酯化2 h后，冷卻10 min至室溫，加入5 mL 6% K2CO3，2 mL正己烷，充分振蕩，取上層液于1.5 mL的離心管中，4000 r/m，離心5 min，取0.6 mL甲酯化的脂肪酸上機分析，使用島津GC-2010高效氣相色譜分析儀，采用氫火焰檢測器。色譜條件參照文獻[22]的條件。采用supelco 37種脂肪酸甲酯混標(supelco美國)識別樣品脂肪酸，各脂肪酸相對含量采用面積歸一化法計算。

1.6 數據統計分析

采用SPSS 18.0軟件對數據進行單因素方差分析，當處理之間差異顯著(P<0.05)時，用Duncan′s檢驗進行多重比較，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 擬微綠球藻粉替代魚油對大菱鲆幼魚肌肉、肝臟及全魚常規營養組成的影響

擬微綠球藻粉替代魚油顯著影響大菱鲆幼魚全魚粗蛋白和粗脂肪含量，對粗灰分和水分的含量影響不顯著(P>0.05)(表3)。試驗組的全魚粗蛋白含量顯著高于對照組(P<0.05)，試驗組的全魚粗脂肪含量顯著降低(P<0.05)。

擬微綠球藻粉替代魚油顯著影響大菱鲆幼魚肌肉的粗蛋白和粗脂肪含量(P<0.05)，其趨勢與全魚結果相同，對粗灰分和水分的含量則影響不顯著(P>0.05)。

表3 微藻粉替代魚油對大菱鲆體組成的影響 %

注：同行數值后不同上標英文字母表示差異顯著(P<0.05)，其他表同.

擬微綠球藻粉替代魚油顯著影響大菱鲆幼魚肝臟的粗蛋白含量，替代8%試驗組顯著高于對照組(P<0.05)，對水分和粗脂肪影響不顯著(P>0.05)。

2.2 微藻粉替代魚油對大菱鲆幼魚肌肉和肝臟脂肪酸的影響

肌肉中的主要脂肪酸分別為C14:0(2.65%～2.73%)、C16:0(19.32%～19.66%)、C18:0(6.18%～6.62%)、C18:1n-9(10.08%～10.43%)、C18:2n-6(6.94%～7.10%)、花生四烯酸(2.04%～2.55%)、二十碳五烯酸(7.32%～7.49%)和二十二碳六烯酸(24.10%～24.68%)(表4)。與對照組相比，肌肉飽和脂肪酸(28.36%～28.60%)、n-6多不飽和脂肪酸(9.08%～9.45%)、n-3多不飽和脂肪酸(33.20%～33.81)和n-3高不飽和脂肪酸(31.59%～32.10%)的百分含量與對照組差異不顯著(P>0.05)，與對照組相比，試驗組肌肉的單不飽和脂肪酸含量先升后降，在替代16%試驗組達到最大值，對照組顯著低于替代16%試驗組(P<0.05)。

肝臟中的主要脂肪酸分別是C14:0(4.42%～5.02%)、C16:0(15.49%～19.07%)、C18:1n-9(12.59%～16.12%)、C18:2n-6(7.50%～7.97%)、C20:1(1.59%～2.07%)、花生四烯酸(1.43%～1.92%)、二十碳五烯酸(5.54%～7.22%)和二十二碳六烯酸(13.56%～14.89%)(表5)。試驗組肝臟的單不飽和脂肪酸和n-3/n-6高不飽和脂肪酸含量呈下降趨勢，替代32%試驗組達到最小值，并顯著低于對照組(P<0.05)。

2.4 微藻粉替代魚油對大菱鲆幼魚生理指標的影響

血清中總超氧化物歧化酶和總抗氧化能力呈先升后降的趨勢，在替代16%試驗組達到最大值并且顯著高于對照組(P<0.05)，血清中溶菌酶也呈先升后降的趨勢，替代16%試驗組和替代24%試驗組顯著高于對照組(P<0.05)，血清中丙二醛呈先降后升的趨勢，在替代16%試驗組達到最低值并且顯著低于對照組(P<0.05)，血清中低密度脂蛋白膽固醇呈下降趨勢，試驗組顯著低于對照組(P<0.05)，血清中甘油三酯和總膽固醇呈下降趨勢，替代24%試驗組和替代32%試驗組顯著低于對照組(P<0.05)(表6)。

表4 微藻粉替代魚油對大菱鲆幼魚肌肉脂肪酸的影響 %

表5 微藻粉替代魚油對大菱鲆幼魚肝臟脂肪酸的影響 %

表6 微藻粉替代魚油對大菱鲆幼魚生理指標的影響

3 討 論

3.1 擬微綠球藻粉替代魚油對大菱鲆幼魚體組成的影響

試驗結果顯示，擬微綠球藻粉替代魚油對大菱鲆幼魚全魚水分影響不顯著，這與張燕等[23]的研究結果一致，說明添加不同的脂肪源飼料對全魚的水分影響不顯著。隨著擬微綠球藻粉的等比例增加，試驗組全魚粗蛋白含量呈先升后降的趨勢，在替代16%試驗組達到最大值，且顯著高于對照組，出現蛋白質沉積增加的原因可能與飼料中花生四烯酸的添加量有關，這與譚青等[24]對大菱鲆的研究結果一致。全魚粗蛋白儲存隨著飼料中花生四烯酸添加量變化而變化，花生四烯酸含量在1.00%～1.21%時顯著高于對照組(0.78%)。本研究中，花生四烯酸的變化主要來源于擬微綠球藻粉的變化，說明在飼料中添加適量的擬微綠球藻粉有利于蛋白質的沉積。試驗組全魚粗脂肪含量呈逐漸下降的趨勢并且顯著低于對照組，這與王成強等[25]對花鱸的研究結果相一致，花鱸魚體粗脂肪含量隨著飼料中花生四烯酸含量升高呈下降趨勢，粗蛋白含量則呈現相反趨勢，本試驗大菱鲆幼魚肌肉組成也有類似的趨勢。粗脂肪含量下降的原因可能有兩個方面。一方面擬微綠球藻粉替代魚油造成飼料的脂肪酸不平衡，而花生四烯酸與脂肪代謝密切相關，花生四烯酸通過抑制載體蛋白apoB100分子的分泌來抑制極低密度脂蛋白的組裝，從而達到調控肝臟脂肪轉運，進而影響脂肪在肌肉中的有效沉積[26]。試驗中花生四烯酸含量隨著擬微綠球藻粉的增加呈上升趨勢，對照組花生四烯酸含量最低，導致對照組飼料脂肪利用效率低下，脂肪沉積量上升，試驗組花生四烯酸含量增多，外源飼料獲得的營養無法滿足試驗組大菱鲆幼魚需要時，通過動用自身的脂肪儲能物質以維持正常的生長需要，可能導致了大菱鲆幼魚全魚粗脂肪含量降低[27-28]。另一方面擬微綠球藻脂肪含量雖然較高,但二十碳五烯酸占總脂肪酸的35%，其他大多數均為色素[23]，故而沉積的脂肪較少，這說明本試驗條件下大菱鲆幼魚飼料中添加擬微綠球藻粉，有利于蛋白質的沉積，且降低了脂肪的有效沉積。

3.2 擬微綠球藻粉替代魚油對大菱鲆幼魚肌肉和肝臟脂肪酸組成的影響

本研究發現，魚體的肌肉和肝臟的脂肪酸組成和飼料的脂肪酸組成有一定的相似性，這與彭墨等[29]研究結果相似，說明在適量的替代水平下肝臟和肌肉脂肪酸組成與飼料脂肪酸組成相似，但也有些特殊的脂肪酸會被優先保留或者利用[30]。試驗組的肌肉飽和脂肪酸(28.36%～28.60%)、n-6多不飽和脂肪酸(9.08%～9.45%)、n-3多不飽和脂肪酸(33.20%～33.81%)和n-3高不飽和脂肪酸(31.59%～32.10%)的含量與對照組無顯著差異，肌肉中單不飽和脂肪酸含量隨替代水平的增加呈先升后降的趨勢，替代水平為16%時達到最大值，已有的研究表明，單不飽和脂肪酸更易于被β-氧化而加以利用[31-33]，這說明可能有些脂肪酸含量過高時，會被優先代謝利用[34]。高不飽和脂肪酸[35-36]主要為n-6和n-3兩個系列，n-6系列主要為花生四烯酸，n-3系列主要為二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，均為海水魚必需脂肪酸[31]。隨著擬微綠球藻粉等比例的增加，肌肉中n-3/n-6高不飽和脂肪酸水平呈逐漸降低趨勢，且替代水平為24%和32%的試驗組顯著低于對照組，出現顯著差異的原因是肌肉中花生四烯酸呈逐漸上升的趨勢，特別是替代水平在24%和32%的試驗組顯著高于對照組，而二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的含量在各處理之間并無顯著變化，這就導致n-3/n-6高不飽和脂肪酸水平出現顯著差異，這與半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[37]和塞內加爾鰨(Soleasenegalensis)[28]的研究結果類似。

本研究中，試驗組肝臟的n-3多不飽和脂肪酸(9.25%～9.59%)和n-3高不飽和脂肪酸(22.42%～23.01%)的含量與對照組無顯著差異。肝臟中的n-6多不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的含量均呈逐漸上升的趨勢，替代水平為24%和32%時達最大值且顯著高于對照組，而單不飽和脂肪酸含量總體呈下降趨勢，與魚體可優先消化吸收飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸，而多不飽和脂肪酸傾向于富集在體內這一研究結果[38]相符，飽和脂肪酸呈上升趨勢而非被優先消化吸收，可能相比單不飽和脂肪酸更難被β-氧化[31-33]。肝臟中二十碳五烯酸呈逐漸上升后趨于平穩的趨勢并顯著高于對照組，而花生四烯酸上升的趨勢要慢于二十碳五烯酸，在替代水平為24%時才顯著高于對照組。其原因可能為，在海水魚體內脂肪酸的代謝競爭主要在花生四烯酸和二十碳五烯酸之間，它們可以相互產生競爭性抑制，本試驗飼料中二十碳五烯酸含量更高時，由二十碳五烯酸生成的類二十烷酸的活性更強反而能抑制花生四烯酸的活性[39]，導致二十碳五烯酸更易富集在體內。肝臟中n-3/n-6高不飽和脂肪酸與肌肉中n-3/n-6高不飽和脂肪酸變化趨勢相近，但替代32%試驗組顯著低于替代24%試驗組，這主要與肝臟中花生四烯酸和二十碳五烯酸的變化有關，替代32%試驗組肝臟花生四烯酸的含量遠高于替代24%試驗組，而二十碳五烯酸的含量并無顯著差異，可能替代水平為24%時，花生四烯酸對二十碳五烯酸開始具有抑制作用[40]，因此n-3/n-6高不飽和脂肪酸在替代24%試驗組和32%試驗組出現顯著差異。

3.3 擬微綠球藻粉替代魚油對大菱鲆幼魚血清生化指標的影響

本試驗通過測定血清生化指標探究擬微綠球藻粉對大菱鲆幼魚的抗氧化能力、非特異性免疫和脂類代謝能力的影響。試驗結果與吳吉林等[9]的研究結果一致，擬微綠球藻粉含有豐富的天然色素，如玉米黃素和蝦青素，可以增強免疫能力和抗氧化能力。大菱鲆幼魚血清中總超氧化物歧化酶和總抗氧化能力呈先升后降的趨勢，在替代水平為16%時達到最大值且顯著高于對照組，說明擬微綠球藻粉替代魚油可以提高大菱鲆幼魚的抗氧化能力，替代水平為16%時達到最大值；本試驗大菱鲆血清中的丙二醛含量呈先降后升的趨勢，在替代16%試驗組達到最低值且顯著低于對照組，說明擬微綠球藻粉替代魚油可以有效地減少大菱鲆幼魚中脂質過氧化物的形成，替代水平在16%時達到最小值。本試驗血清中溶菌酶含量也呈先升后降的趨勢，替代16%試驗組和替代24%試驗組顯著高于對照組，說明擬微綠球藻粉替代魚油可以提高大菱鲆幼魚的非特異免疫力，替代水平在16%和24%時達最大值；試驗魚機體脂類代謝情況主要參考血清甘油三酯和膽固醇的含量，與飼料中的脂肪水平呈正相關[41]。血清中的甘油三酯和膽固醇呈下降趨勢，替代24%試驗組和替代32%試驗組顯著低于對照組，這可能有兩方面的原因：一是擬微綠球藻粉中有一部分是色素,機體對這部分脂類物質的吸收利用率很低，導致脂肪沉積率低[31]；二是血清中高密度脂蛋白負責將血液中的膽固醇轉運到肝臟，而低密度脂蛋白負責將膽固醇和甘油三酯轉運到血液，二者共同影響了血清中膽固醇和甘油三酯的含量[42]。在本試驗中，與對照組相比，試驗組的高密度脂蛋白膽固醇無顯著變化，而低密度脂蛋白膽固醇含量逐漸下降，甘油三脂和總膽固醇的變化趨勢與低密度脂蛋白膽固醇一致，這表明低密度脂蛋白膽固醇的下降減少了膽固醇自肝臟至血清的運輸，從而降低了血清中甘油三酯和膽固醇的含量。因此，添加適量擬微綠球藻粉可以降低大菱鲆的血脂水平，有利于大菱鲆的血脂健康。

4 結 論

綜上所述，在本試驗條件下擬微綠球藻粉替代魚油提高了大菱鲆幼魚花生四烯酸的含量，促進了魚體對蛋白的沉積和脂肪利用，且能保持大菱鲆幼魚高不飽和脂肪酸含量無顯著變化，維持其營養價值；添加16%～24%的擬微綠球藻粉替代魚油，提高了試驗魚的免疫性能和抗氧化能力。