泥東風螺線粒體基因組及其遺傳多樣性分析

熊 鋼，周先文，王曉清，巫旗生，康 驪，秦 溱，曾志南

( 1.湖南生物機電職業技術學院，湖南 長沙 410127； 2.水產高效健康生產湖南省協同創新中心，湖南 常德 415000； 3.湖南農業大學，湖南 長沙 410128； 4.福建省水產研究所，福建 廈門 361013 )

東風螺屬(Babylonia)屬軟體動物門、腹足綱、新腹足目、蛾螺科[1]，俗稱花螺、南風螺和泥螺等，是我國沿海重要的經濟軟體動物。我國現有方斑東風螺(B.areolata)、泥東風螺(B.lutosa)和臺灣東風螺(B.formosae)3種[2-3]。泥東風螺肉質鮮美，是暢銷的優質海產貝類，在近十年開發為海水養殖品種[4-5]。然而泥東風螺野生資源銳減，為此泥東風螺人工繁育[6-7]、人工增殖[8]和增殖效果評估[9]相關研究工作相繼開展。

泥東風螺作為后生動物，其線粒體DNA為典型的環狀雙鏈分子結構, 長度大多為14～18 kb，編碼37個基因，包括13個蛋白質基因、22個tRNA以及12S RNA和16S RNA[10]。線粒體基因組是核外遺傳物質,具有分子量小、結構簡單、母系遺傳等特點,成為生物多樣性、群體遺傳學與系統進化研究中的重要分子標記[11-12]。目前，線粒體基因已作為種類鑒定、系統發育分析和群體遺傳多樣性的重要分子標記，并且線粒體ND2、16S RNA、Cyt b基因、D-loop序列已被應用于貝類[13-14]、甲殼類[15]、魚類[16-17]等水產動物物種遺傳多樣性及系統發育關系分析中。

為調查泥東風螺野生群體資源遺傳多樣性，筆者采用PCR擴增和直接測序技術對采自北海、連江和長樂的野生泥東風螺群體樣本進行群體遺傳多樣性和遺傳距離分析，從分子水平闡明我國沿海泥東風螺的遺傳性狀，研究結果將為泥東風螺資源恢復、保護和利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

泥東風螺為自福建連江(30個樣本)、福建長樂(30個樣本)和廣西北海(30個樣本)捕撈的野生泥東風螺群體。

1.2 總DNA的提取

取泥東風螺腹足，采用天澤基因柱式動物DNA提取試劑盒提取泥東風螺總DNA。總DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20 ℃保存備用。

1.3 基因擴增和測序

以獲得的泥東風螺轉錄組中線粒體基因信息設計擴增引物[18]，擴增福建連江野生泥東風螺樣本總DNA。PCR擴增條件為：95 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共33個循環；最后72 ℃延伸5 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳、切膠和回收純化后送鉑尚生物進行雙向測序。

表1 泥東風螺線粒體基因組擴增引物

1.4 線粒體基因組環狀結構和序列分析

將送檢測序結果用DNAMAN軟件進行校對和人工去除錯誤拼接(GenBank登陸號：KF897830)。利用OGDraw軟件[19]對泥東風螺線粒基因組進行制圖，并在GenBank中進行Blast分析；采用Mega 5.1[20]軟件構建最大似然法和鄰接法物種線粒體基因組分子系統樹，1000次重復抽樣自展法評估各分支的置信度。用DnaSp 5.1[21]軟件分析3個野生群體基因的遺傳多樣性參數，使用Mega 5.1[20]軟件計算群體內和群體間的遺傳距離。

2 結果與分析

2.1 線粒體基因組環狀結構

OGDraw構建的泥東風螺線粒體基因組結構(圖1)表明，泥東風螺線粒體基因組含有13個蛋白質編碼基因、22個tRNA和2個rRNA；其中ATPase6、ND1、ND4L基因的終子密碼子為TAG，ND5基因則為不完全終子密碼子；其中ND2與COXⅠ，tRNA-Trp與tRNA-Gln，tRNA-Gly與tRNA-Glu，tRNA-Glu與12S RNA、tRNA-Glu，ND6與Cytb、ND4L與ND4基因存在重疊區；在環狀線粒體基因結構中，tRNA-Met、tRNA-Tyr、tRNA-Cys、tRNA-Trp、tRNA-Gln、tRNA-Gly、tRNA-Glu和tRNA-Thr位于環形線粒體L鏈上。

2.2 基因相似性和保守性分析

在GenBank基因庫中進行相似性分析得到17種腹足綱貝類動物線粒體基因組(表2)。使用DNAMAN軟件分析泥東風螺與17種腹足綱動物線粒體基因組全長及線粒體上12S RNA、16S RNA、COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ、和Cytb基因相似性(表3)。研究結果表明，18種腹足綱動物線粒體基因組間相似性為70.1%～92.9%；泥東風螺與其他貝類間的相似性為74.1%～92.9%，泥東風螺與方斑東風螺相似性最高，達92.9%；除與似鮑羅螺(Concholepasconcholepas)的COXⅢ基因相似性為50.4%外，泥東風螺線粒體上的COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ、12S RNA、16S RNA、Cytb基因與其他17個物種對應基因的相似性為70.07%～99.00%；將泥東風螺與其他貝類線粒體基因組全長及各基因相似性作折線圖(圖2)可知，12S RNA和16S RNA相似性折線與線粒體基因組全長相似性折線變化相似。經12S RNA和16S RNA基因保守性分析發現，物種之間12S RNA的391～491 bp區域為高度變異區，物種之間16S RNA的1～106 bp和361～481 bp區域為高度變異區，而物種之間16S RNA的1191～1317 bp區域為高度保守區；物種之間COXⅢ相似性與線粒體基因全長相似性表現相當，而COXⅠ、COXⅡ基因相似性更高，這兩個基因的物種間相似性均值分別為82.96%和83.00%。

圖1 泥東風螺線粒體基因組環狀結構

GenBank登錄號物種長度/bpKF897830泥東風螺15 346GU196685榧螺(Amalda northlandica)15 354DQ238598東泥織紋螺(Ilyanassa obsoleta)15 263EU827201織紋螺(Nassarius reticulatus)15 271DQ284754黑點卷管螺(Lophiotoma cerithiformis)15 380KM213962脈紅螺(Rapana venosa)15 272EU827194染料骨螺(Bolinus brandaris)15 380DQ159954蚵巖螺(Thais clavigera )15 285EU827200黑齒法螺(Cymatium parthenopeum)15 270JQ446041似鮑羅螺15 495EU827197錐螺(Fusiturris similis)15 595EU440735擬釘螺(Tricula hortensis)15 179KJ587748方斑東風螺15 356KT962044水泡蛾螺(Buccinum pemphigus )15 265KT382829培利渦螺(Volutharpa perryi)15 255KU246047香螺(Neptunea arthritica)15 256KM603509縱肋織紋螺(Varicinassa variciferus )15 269KP716635蟾蜍鼓螺(Galeodea echinophora)15 388

表3 腹足綱貝類線粒體基因組相似性 %

圖2 泥東風螺與17種腹足綱貝類線粒體基因相似性1.榧螺；2.東泥織紋螺；3.織紋螺；4.黑點卷管螺；5.脈紅螺；6.染料骨螺；7.蚵巖螺；8.黑齒法螺；9.似鮑羅螺；10.錐螺；11.擬釘螺；12.方斑東風螺；13.水泡蛾螺；14.培利渦螺；15.香螺；16.縱肋織紋螺；17.蟾蜍鼓螺.

2.3 系統進化分析

由Mega 5.1[20]軟件最大似然法和鄰接法構建的線粒體基因組系統發生樹(圖4)可知，蛾螺科中泥東風螺和方斑東風螺聚成一支，織紋螺科的織紋螺和縱肋織紋螺于蛾螺科內后聚成一支；圓口螺科的擬釘螺獨立成支；榧螺和東泥織紋螺聚成一支，似鮑羅螺與骨螺科相似性較高；由這18種軟體動物線粒體基因組構建的系統發育樹看，線粒體基因組系統發育樹與形態學分類有異。

2.4 序列變異特征分析

3個野生泥東風螺群體每個群體取3個個體擴增線粒體基因組全長序列，比對試驗試驗結果發現，在COXⅠ與COXⅡ基因相連區域有較多的變異位點。進一步對3個群體內各30個野生泥東風螺DNA樣本以引物F5擴增測序，結果表明，變異位點分布在4067～4784 bp區域，共40個變異位點(圖5)，變異均為轉換或顛換，沒有檢測到插入和缺失現象。

圖3 腹足綱貝類12S RNA和16S RNA基因保守區和變異區

2.5 群體遺傳多樣性和遺傳結構

泥東方螺各野生群體的單倍型分布(表4)和群體遺傳距離(表5)分析表明，連江野生群體和北海野生群體中均檢測到10個單倍型，而北海野生群體中檢測到16個多態位點，3個野生群體的單倍型多樣性為(0.406±0.112)～(0.532±0.113)，3個野生群體的核苷酸多樣性為(0.00094±0.00124)～(0.00111±0.00123)；北海野生群體與連江野生群體和長樂野生群體之間的遺距離分別僅為0.00094和0.00099。

圖5 F5引物擴泥東風螺線粒體基因組片段序列變異位點

種類年齡體質量/g體長/cm全長/cm鰱魚2齡706.2±110.335.1±1.9542.7±2.12(n=9)510～86530.6～37.537.6～45.03齡1148.1±244.240.5±4.0549.0±4.64(n=8)925～168534.6～48.042.2～56.84齡2058.3±166.649.3±2.4759.5±3.10(n=6)1880～221047.2～52.056.8～62.9鳙魚2齡858±70.235.64±0.9343.6±1.03(n=7)780～98534.2～36.941.8～45.23齡1641.7±143.444.82±0.8653.5±0.61(n=6)1415～181543.3～45.752.6～54.04齡3391.7±385.857.0±2.3868.6±2.92(n=5)2890～402553～59.464.3～72.05齡7495.7±510.374.1±4.4892.3±3.51(n=5)6921～789669.9～78.889～96

表5 泥東風螺群體遺傳距離

3 討 論

3.1 線粒體基因組遺傳進化

對18種腹足綱動物線粒體基因組保守性分析發現，12S RNA的391～491 bp區域和16S RNA的1～106 bp和361～481bp區域為高度變異區，16S RNA的1191～1317 bp區域為高度保守區。泥東風螺作為后生動物，線粒體基因組中常含有多個長度不等的非編碼區[22]，通常認為在最大的非編碼區中包含有線粒體基因復制和轉錄信號,這些非編碼區被稱為控制區[10]，在其他水產動物中非編碼控制區存在D-loop結構[17]，但在本研究的泥東風螺線粒體基因組非編碼區未發現D-loop結構。另外，泥東風螺線粒體基因組中也未發現在后生動物線粒體控制區中常見的較高AT含量的簡單串連重復序列[23]，這種結構在線粒體基因的復制和轉錄的早期階段發揮著重要作用[23-24]。

3.2 泥東風螺野生群體遺傳分化

遺傳多樣性是生物多樣性的基礎和物種進化潛能的保證，基因核苷酸多樣性是衡量線粒體基因遺傳多樣性的重要指標。本研究采用16S RNA[25]和COXⅠ[26]基因通用引物對3個泥東風螺野生群體擴增片段測序，結果比對并未發現變異位點。但在比對3個群體中擴增的部分泥東風螺線粒體基因組全長序列后發現，COXⅠ和COXⅡ基因相鄰區域附近存在較多變異位點，進一步用F5引物擴增測序發現，野生泥東風螺線粒體基因組變異位點主要分布在4067～4784 bp區域，3個野生群體在此片段共檢測到40個變異位點，26個單倍型，整體遺傳多樣性較低；泥東風螺種內變異區間自COXⅠ基因的3′編碼區段至COXⅡ基因的5′編碼區，40個變異位點在COXⅠ基因3′編碼區、COXⅡ基因5′編碼區和COXⅠ與COXⅡ基因相鄰的非編碼區無明顯的分布特征。通常物種間基因的非編碼區為變異區，但在線粒體上各相鄰基因的非編碼區段非常短，有的相鄰基因甚至共用編碼區。如泥東風螺線粒體上基因存在12個基因共用編碼片段，12個相鄰基因間無非編碼的堿基相隔，且相鄰基因間的非編碼區長度也為0～58 bp，可能是這種現象使得種內基因變異位點在非編碼區分布不集中。考慮泥東風螺野生資源減少，因此推測野生群體遺傳進化潛力水平受到了人工捕撈的影響，核苷酸變異和分化程度較低。連江和長樂野生群體之間的遺傳距離相對北海群體較高的原因除地理因素之外還有人工捕撈因素，因此促進了兩群體之間的基因交流。

由于所涉及野生樣品數量限制，本研究只使用線粒體基因突變位點較多的片段序列進行分析，因此，下一步還需結合微衛星[27]和擴增片段長度多態性[28]指紋相關的分子標記技術，更全面地評估野生泥東風螺資源狀況和泥東風螺人工增殖效果。本研究為利用線粒體進行泥東風螺群體的分子遺傳學、遺傳結構和種質鑒定提供參考依據。