黃連素對海水病原菌的殺滅效果及藥效穩定性

王 凱，于永翔,2，張 正,2,3，王印庚,2,3，廖梅杰,2,3

( 1.中國水產科學研究院 黃海水產研究所，山東 青島 266071； 2.青島海洋科學與技術國家實驗室, 海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，山東 青島 266071； 3.農業農村部海水養殖病害防治重點實驗室，山東 青島 266071 )

大規模病害的頻繁發生，給水產養殖業造成了嚴重的經濟損失[1]，成為制約產業發展的主要問題之一。這其中，以細菌為病原的疾病更為常見。水產動物的細菌性疾病普遍具有傳染快、死亡率高等顯著特點，往往成為決定養殖成活率的關鍵性因素之一。目前，水產養殖細菌性病害防治手段主要包括傳統化學藥物、漁用疫苗、微生態制劑和中草藥等。相比于疫苗和微生態制劑，藥物的使用在我國現階段的養殖生產中更為常見。傳統化學藥物包括抗生素和消毒劑，在疾病防控中起效快、效果直接，但也伴隨著環境污染[2]和耐藥基因遷移與整合等[3]諸多問題，因此受到越來越嚴格的管控。在西方發達國家，對于水產疾病的防控多以疫苗為主[4]。雖然我國漁用疫苗的研究起步于20世紀70年代，但迄今為止也僅有4個疫苗獲得國家新獸藥證書，其中只有草魚出血病滅活疫苗被列入國家獸藥標準。我國微生態制劑的研究始于1979年，迄今也只有蛭弧菌(Bdellovibrio)微生態制劑為國家級二類新獸用微生物生態制品，同時也是我國唯一獲得國家批準的二類獸用微生物制劑。因此，我國水產疫苗和微生態制劑的應用[5]在現階段依然受到各種因素的限制，面對種類多樣的細菌性病原，水產養殖產業中對于疾病防控更多的還是依靠藥物。

與抗生素等化學藥物相比，中草藥具有產物天然、安全無污染、不易產生耐藥性等優勢，特別是其中的某些成分還兼具免疫增強效果，可以提高動物機體免疫能力[6-7]。但中草藥大多成分復雜，特別是在水環境條件下更難以進行深入的藥理和藥效研究，因此中草藥單體成為水產動物疾病防控研究的主要方向之一。

黃連素又稱小檗堿，屬異哇琳生物堿，天然品主要存在于小檗科、罌粟科、毛莨科、蕓香科等植物中[8]，具有抗炎、抗癌、抑菌、降脂、降糖等廣泛的藥理作用[9]。本研究以黃連素為主要研究對象，選取10種水產動物常見的病原菌，進行黃連素的體外抑菌和殺菌劑量測定。同時，以美人魚發光桿菌美人魚亞種(Photobacteriumdamselaessp.damselae)為指示菌，進行黃連素的藥效穩定性研究。美人魚發光桿菌美人魚亞種分離自山東省長島縣大型深水網箱養殖的患病許氏平鲉(Sebastesschlegeli)病灶，該菌通過人工感染試驗證實對許氏平鲉具有極強的致病性，且其分離環境無過往用藥史，適宜作為藥效研究的指示菌。研究結果旨在為黃連素乃至中草藥在水產疾病防控上的規范應用提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用菌種中遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)[10]、鰻弧菌(Vibrioanguillarum)[11]、鯊魚弧菌(V.carchariae)[12]分離自患出血病的褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)，溶藻弧菌(V.alginolyticus)和大菱鲆弧菌(V.scophthalmi)[13]分離自患病大菱鲆(Scophthalmusmaximus)，哈維氏弧菌(V.harveyi)[14]、假交替單胞菌(Pseudoalteromonasnigrifaciens)[15]分離自保苗期仿刺參(Apostichopusjaponicus)，美人魚發光桿菌美人魚亞種、輪蟲弧菌(V.rotiferianus)分離自患病許氏平鲉，副溶血弧菌(V.parahemolyticus)[16]分離自患化板癥的仿刺參。以上菌種均由中國水產科學研究院黃海水產研究所實驗室保存，并已驗證其致病性。

試驗用黃連素標準品(純度≥98%)購于索萊寶科技有限公司。

1.2 菌種培養與菌液制備

將超低溫保存的試驗菌株于MH瓊脂培養基上28 ℃劃線培養24 h，挑選純菌落轉接3次后，再挑取單菌落接種到滅菌MH肉湯培養基中，制作菌懸液母液，分光光度法調節菌液密度至1.0×107cfu/mL。

1.3 最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度測定

參考文獻[17]中的二倍稀釋法做適當改進，用無菌生理鹽水將黃連素稀釋成質量濃度為1600 mg /L 的母液。取10支滅菌試管，1號試管加入3.6 mL MH液體培養基和6.4 mL黃連素母液混勻，2～8號試管加入5 mL MH液體培養基，以二倍稀釋法進行倍比稀釋，最終使各管黃連素質量濃度為1024、512、256、128、64、32、16、8 mg/L，9號試管加5 mL黃連素母液做陰性對照，10號試管加5 mL MH液體培養基作陽性對照。除9號試管外，其余每管加入0.1 mL 菌懸液，輕輕晃動混勻。在28 ℃、180 r/min下培養16～18 h，觀察試管中培養結果。結果判定，試管內液體呈現渾濁即為有菌生長，清澈透明則為無菌生長，以無菌生長的最低稀釋度確定為最小抑菌質量濃度值。每個質量濃度設3個平行。在最小抑菌質量濃度測定的基礎上，從無混濁試管開始向上2個稀釋度共3 個試管中各吸取0.1 mL 樣液，接種至MH瓊脂培養基，28 ℃培養16～18 h后觀察，平板菌落不超過5個的相應試管中的藥物質量濃度即為該種藥物對供試菌株的最小殺菌質量濃度。

1.4 黃連素穩定性初步研究

1.4.1 不同溫度處理對黃連素殺菌效果的影響

選取美人魚發光桿菌美人魚亞種為指示菌，菌液密度調節至1.0×107cfu/mL。參考指示菌的最小殺菌質量濃度，用無菌純水配制相同質量濃度的黃連素溶液，分別置于4、20、40、60、80、100、121 ℃溫度下處理30 min，待恢復至室溫后，分別取試管按5 mL黃連素溶液+5 mL MH液體培養基+100 μL菌液配置體系(此時體系中黃連素質量濃度為最小殺菌質量濃度)，對照組體系為5 mL黃連素溶液+5 mL MH液體培養基+100 μL菌液(黃連素為室溫處理)，混勻后28 ℃、180 r/min培養，20 min后吸取0.1 mL涂布胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂平板，計算殘留的細菌數量，并按下式計算不同溫度處理下黃連素的殺菌率，試驗設3次重復。

100%

1.4.2 不同貯存時間對黃連素殺菌效果的影響

將上述20、60、100 ℃處理的黃連素溶液于室溫下避光存儲，于第1、7、14、28、35 d后計算殺菌率，比較不同溫度處理和不同時間存儲后黃連素的藥效穩定性。

1.4.3 不同Na+、Ca2+、K+、Mg2+質量濃度對黃連素殺菌效果的影響

根據海水的鹽度配比，分別設置NaCl的質量濃度梯度為0、5、10、15、20、25 mg/L，CaCl2、KCl、MgCl2的質量濃度梯度為0、1、2、3、4、5 mg/L。以對應鹽溶液配置質量濃度為2倍最小殺菌質量濃度的黃連素溶液，對照組不加黃連素，計算殺菌率，分析不同金屬離子質量濃度下黃連素的殺菌效果。

1.4.4 數據處理

運用Excel 2016和SPSS 19.0試驗數據進行處理，殺菌率相關數據均用平均值±標準差表示。

1.5 安全性試驗

藥物安全性試驗以人工繁育的許氏平鲉為參考物種，以藥浴方式進行。試驗魚購自威海某育苗場，體質量(37.1±5.0) g。取健康許氏平鲉40尾，禁食1 d后，分為3個試驗組和1個對照組，每組設置2個平行，即每個平行5尾魚。試驗于50 L水槽中進行，根據測定的黃連素對指示菌的最小殺菌質量濃度，設定3個試驗組黃連素質量濃度分別為50%、1倍和2倍最小殺菌質量濃度值，對照組不做處理。試驗全程不換水，正常充氣，12 h后對照組和試驗組各投喂10 g顆粒餌料，觀察試驗組和對照組的活力及攝食狀況，并于24 h后再次觀察魚的活力及死亡率。

2 結 果

2.1 黃連素對10種水產細菌性病原的最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度

測定黃連素對10種水產病原菌的最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度，試驗結果見表1、圖1。由表1、圖1可見，黃連素對10種病原菌的最小抑菌質量濃度為64～256 mg/L。其中，黃連素對大菱鲆弧菌和溶藻弧菌抑菌作用最明顯，最小抑菌質量濃度為64 mg/L；對鰻弧菌、遲緩愛德華氏菌、美人魚發光桿菌、鯊魚弧菌、假交替單胞菌和輪蟲弧菌的抑菌作用次之，最小抑菌質量濃度為128 mg/L；對哈維弧菌和副溶血弧菌抑菌作用較弱，最小抑菌質量濃度為256 mg/L。黃連素對10種病原菌的最小殺菌質量濃度為256～1024 mg/L。其中，對鰻弧菌、大菱鲆弧菌、遲緩愛德華氏菌、溶藻弧菌、鯊魚弧菌和輪蟲弧菌殺菌作用最強，最小殺菌質量濃度為256 mg/L；對美人魚發光桿菌、副溶血弧菌和假交替單胞菌的殺菌作用次之，最小殺菌質量濃度為512 mg/L；對哈維氏弧菌殺菌作用較弱，最小殺菌質量濃度為1024 mg/L。

2.2 溫度和儲存時間對黃連素殺菌效果的影響

以美人魚發光桿菌美人魚亞種為指示菌，測定不同溫度及時間處理下黃連素對指示菌的殺菌對數值，試驗結果見表2、表3。結果表明，512 mg/L的黃連素溶液在4～121 ℃條件下處理30 min，對指示菌的殺菌率均超過99%，且無明顯差異。試驗結果表明，黃連素的抑菌效果不受溫度的影響；20、60 ℃及100 ℃處理的黃連素分別于室溫存放1、7、14、28、35 d后，對指示菌的殺菌率依然均超過99%，表明存放時間對黃連素的殺菌效果無明顯影響。

表1 黃連素對10種水產病原菌的最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度 mg/L

圖1 黃連素對10種病原菌的最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度1.鰻弧菌；2.哈維弧菌；3.大菱鲆弧菌；4.遲緩愛德華氏菌；5.美人魚發光桿菌；6.副溶血弧菌；7.溶藻弧菌； 8.鯊魚弧菌；9.假交替單胞菌；10.輪蟲弧菌.

溫度/℃420406080100121殺菌率99.21±0.0299.32±0.0499.34±0.199.57±0.0799.55±0.0599.53±0.1199.48±0.07

表3 存放時間對黃連素殺菌率的影響 %

2.4 不同Na+、Mg2+、Ca2+、K+質量濃度對黃連素殺菌效果影響

分別用質量濃度為0、5、10、15、20、25 mg/L的NaCl鹽溶液配置512 mg/L的黃連素溶液，作用30 min后，殺菌率均超過99%，質量濃度為0、1、2、3、4、5 mg/L的MgCl2、CaCl2、KCl的鹽溶液配置同等質量濃度的黃連素溶液，作用30 min后殺菌率也均超過99%(圖2)。結果表明，Na+、Mg2+、Ca2+、K+等離子對黃連素的殺菌效果無顯著影響。

圖2 不同金屬離子質量濃度對黃連素殺菌效果的影響

2.5 黃連素安全性試驗結果

試驗組和對照組許氏平鲉12 h后均無死亡，投喂餌料后50%最小殺菌質量濃度和最小殺菌質量濃度試驗組攝食情況與對照組無顯著差異，攝食完成后均無殘餌，而2 倍最小殺菌質量濃度試驗組則有少量殘餌。試驗24 h后，各試驗組與對照組均無死亡，試驗魚活力正常(表4)。

表4 黃連素對許氏平鲉的安全性試驗

3 討 論

3.1 中草藥殺菌效果研究

疾病的普遍發生給水產養殖生產帶來嚴重的壓力，抗生素和化學藥物的頻繁使用也不斷誘導水產病原菌耐藥性的產生，增加了對疾病的防治難度。而中草藥源遠流長，并經歷了數千年的篩選和應用，長時間的人類臨床應用經驗和無數的動物試驗研究對中草藥的有效性均做出了肯定[18]，近年來中草藥在抑菌殺菌方面的效果也得到證實[19]。阿琪瑪等[20]研究了金銀花、黃連、何首烏、地榆、五味子、穿心蓮、虎杖等16種中草藥對牛源致病性大腸桿菌(Escherichiacoli)的體外抑菌效果，結果表明，金銀花和黃連對大腸桿菌O1體外抑菌效果最好，五味子對大腸桿菌O8體外抑菌效果最好，而虎杖的體外抑菌效果最差。梁利國等[21]采用瓊脂擴散法測定了五倍子等18種中草藥對鰻弧菌、副溶血弧菌、河口弧菌(V.aestuarianus)及霍亂弧菌(V.cholerae)等4種病原弧菌的抑制作用，五倍子、蘇木、地錦草、石榴皮、黃芩、虎杖和山楂7種中草藥對病原弧菌具有較好的抑菌效果，而金銀花等11種中草藥抑菌作用較弱。但這些研究多集中在對中草藥單方或復方研究，研究對象為多種藥物成份的復合物，并未對起效成份的藥效學和藥理學進行深入細致的分析。

3.2 中藥單體殺菌效果研究

與復方中藥相比，中藥單體成份明確，易于進行定性、定量[22]和開展藥效學的研究。黃連素作為中藥提取物，為苯丙異喹啉類季銨型生物堿，具有廣譜抗菌作用，并已在動物醫學和人類臨床上應用多年[23-27]。謝麗鈴等[28]研究表明，黃連素對副溶血弧菌、溶藻弧菌和嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)3種水產病原菌的最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度分別為0.391 mg/mL和0.391 mg/mL、0.391 mg/mL和 0.781 mg/mL、0.781 mg/mL和1.563 mg/mL，且黃連素會嚴重破壞病原菌的菌體形態，使病原菌的遲緩期延長2～7 h。其中，對溶藻弧菌的最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度均大于本試驗研究結果(64 mg/L和256 mg/L)，這可能與試驗所用黃連素藥物的來源有關。本試驗以純品黃連素為對象，用最小二倍法對黃連素進行抑菌作用的初步測定。試驗結果表明，黃連素對10種革蘭氏陰性水產病原菌均具有較強的抑制和殺滅作用。經不同溫度處理后的黃連素對目標仍具較強的殺菌效力，說明溫度變化并不會影響黃連素的殺菌藥效。而且經121 ℃熱處理后的黃連素仍具有較好的殺菌效果。由此可知，黃連素適用于人工配合飼料的制配生產工藝，可以拌于餌料中進行不高于121 ℃的高溫滅菌。藥效穩定性的研究也表明，即使經不同溫度處理后的黃連素溶液室溫存放35 d后殺菌效果依然無明顯變化，說明其結構性質比較穩定，可以耐受大多數儲存條件。用不同離子質量濃度配制的黃連素溶液殺菌效果也無明顯變化，初步表明，黃連素的使用不受水中Na+、Mg2+、Ca2+、K+等金屬離子的影響，因此也適用于海水養殖環境。

試驗結果表明，黃連素對主要海水養殖病原菌的殺菌效果較好，且藥物特性非常穩定，適宜作為水產藥物進行產業開發。同時，在研究過程中以許氏平鲉為試驗對象，進行黃連素對海水魚類的初步安全性檢測，試驗發現，雖然各質量濃度的黃連素長時間藥浴并未造成許氏平鲉的死亡，但1024 mg/L的劑量已對許氏平鲉的攝食產生了相應的影響。長期以來，研究人員對黃連素及各種衍生物的安全性論證從未停止。趙錫艷等[29]詳盡地從動物試驗、臨床研究及個案報道等方面論述了黃連單方及其主要成分對人和小鼠的不良反應，如便秘、腹瀉、過敏等；何蕾等[30]從DNA層面報道了鹽酸小檗堿對小鼠肝、脾、腎細胞DNA損傷的影響，鹽酸小檗堿可引起肝、脾、腎DNA損傷，并呈顯著的劑量—效應關系。以上研究均表明，黃連素的臨床使用應嚴格控制劑量。而在水產動物的研究領域尚未見黃連素不良反應的報道。通過本次試驗，也初步證實了黃連素可能對魚類的攝食造成一些負面影響，而不同物種對黃連素的耐受情況必然會有差別，因此在考慮黃連素作為水產殺菌藥物的同時，更應深入研究黃連素對不同水產動物的安全質量濃度范圍，以期為黃連素在水產病害方面的應用提供更為精確的參考。