AR-A014418對γδT細胞增殖、凋亡及殺傷功能的影響①

鄭 璐 孫蕾清 陳復興 周 燏 呂小婷 陳 玲 李 瑩 周忠海 陳永強

(解放軍第97醫院中心實驗室，徐州221004)

Wnt/β-catenin信號通路是一條在進化中極為保守的通路，在調控干細胞的形成、細胞的分化、增殖和凋亡等生理過程中起重要作用[1,2]。由于在許多腫瘤中Wnt/β-catenin信號通路異?；罨?，許多研究發現該通路可以作為腫瘤治療的靶點并研發出一系列Wnt信號通路抑制劑，目前已經進入臨床試驗[3,4]。近年來腫瘤患者自身免疫細胞及嵌合抗原受體T(CAR-T)細胞免疫療法成為研究的熱點。Gattinoni等[5]利用Wnt信號通路激活劑TWS119活化T淋巴細胞的Wnt/β-catenin信號通路可以獲得一群在體內具有較強的增殖和腫瘤殺傷活性的干細胞樣記憶CD8+T細胞 (TSCM)，而且還發現CD19-CAR TSCM體內抗腫瘤效果優于傳統的CD19-CAR T細胞[6]。我們前期研究發現TWS119還可以調節γδT細胞的分化、增殖及腫瘤殺傷活性[7,8]。AR-A014418(圖1)也是一種選擇性的GSK3β抑制劑，可以通過抑制GSK3β酶活性活化Wnt信號通路[9]。因此，本研究想觀察Wnt信號通路激活劑AR-A014418對γδT細胞增殖、凋亡及其腫瘤殺傷活性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 AR-A014418購自MCE公司，用二甲亞砜(DMSO)溶解配制成20 mmol/L的母液于-20℃儲存；Annexin V-FITC/7-AAD apoptosis 試劑盒購自杭州聯科生物技術股份有限公司；CFSE購自Invitrogen公司；帕米磷酸二鈉購自深圳海王藥業有限公司；RPMI1640和小牛血清購自Gibco 公司；人淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司；熒光抗體APC-pan γδTCR和FITC-γδ2TCR購自BD公司；Western及IP細胞裂解液試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒、PVDF膜和BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒購自碧云天生物技術研究所；兔抗人Bcl-2、Bax、Caspase-3和β-Tublin一抗購自Abcam公司；人AB型血清購自徐州市血站。

1.2方法

1.2.1γδT細胞的培養及鑒定 抽取健康人外周抗凝血10 ml，用生理鹽水1∶1稀釋后加入淋巴細胞分離液，1 800 r/min離心15 min，分離獲得人外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)。將分離獲得的PBMCs加入γδT細胞完全培養基(含10%小牛血清、5%AB血清、3 μmol/L的帕米膦酸二鈉和200 U/ml rhIL-2)中置于37℃、5%CO2培養箱中培養10 d。取培養10 d的γδT細胞用APC-pan γδTCR和FITC-γδ2TCR抗體標記細胞用流式細胞儀進行γδT細胞鑒定。

1.2.2細胞計數儀法檢測AR-A014418對γδT細胞增殖的影響 取培養10 d的γδT細胞，調整細胞數1.0×106ml-1加入12孔板，加入終濃度分別為0.3、1、3、10 μmol/L的AR-A014418，每組設3個復孔，對照組加入等量的DMSO。培養72 h后取每組的細胞懸液用細胞計數儀進行細胞計數。

圖1 AR-A014418結構式Fig.1 Structure of AR-A014418

1.2.3流式細胞儀檢測AR-A014418對γδT細胞增殖的影響 取培養10 d的γδT細胞，用生理鹽水將γδT細胞配成濃度為1.0×107ml-1的細胞懸液，加入終濃度為1 μmol/L的CFSE，37℃孵育15 min后加入10倍體積的完全培養基終止染色，離心洗滌2遍后，將CFSE標記的γδT細胞接種于12孔培養板，然后加入終濃度分別為0.3、1、3、10 μmol/L的AR-A014418，對照組加入等量的DMSO。于37℃、5%CO2培養箱中培養72 h。收集細胞并用PBS洗滌1次，每管加入anti-γδTCR-APC 5 μl，室溫避光孵育15 min，PBS洗滌后，重懸于0.5 ml的PBS溶液中，用流式細胞術檢測γδT細胞的增殖情況，試驗重復3次。

1.2.4流式細胞儀檢測AR-A014418對γδT細胞凋亡的影響 取培養10 d的γδT細胞，調整細胞數1.0×106ml-1加入12孔板，加入終濃度分別為0.3、1、3、10 μmol/L的AR-A014418，對照組加入等量的DMSO。培養72 h后收集細胞并用PBS洗滌1次，根據Annexin V-FITC/7-AAD 凋亡試劑盒說明書操作步驟，每管分別加入Annexin V-FITC和7-AAD，染色結束后用流式細胞術檢測γδT細胞凋亡比例，試驗重復3次。

1.2.5流式細胞儀檢測γδT細胞體外殺傷活性 將AR-A014418處理72 h后的γδT細胞(效應細胞)與CFSE標記的人肝癌HepG2細胞和人胃癌SGC-7901細胞(靶細胞)按照效應細胞與靶細胞10∶1和20∶1的比例加入96孔U型孔中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養6 h。收集細胞并用PBS洗滌1次，每管加入7-AAD 5 μl,室溫避光孵育5 min后，重懸于0.5 ml的PBS溶液中，用流式細胞術檢測HepG2和SGC-7901細胞的凋亡情況，試驗重復3次。

1.2.6Western blot分析蛋白的表達 γδT細胞經AR-A014418處理72 h后，收集細胞用Western及IP細胞裂解液50 μl充分裂解提取蛋白，BCA法測樣品蛋白濃度后用12%SDS-PAGE分離，轉膜，5%的脫脂奶粉封閉2 h，一抗(1∶1 000) 4℃封閉過夜，二抗(1∶1 000) 37℃孵育1 h。然后用成像系統檢測并拍照，試驗重復3次。

2 結果

2.1γδT細胞鑒定 分離獲得人外周血單個核細胞，于37℃、5%CO2培養箱中用γδT細胞完全培養基培養10 d后流式細胞儀鑒定，結果如圖2A、B顯示，Pan γδT細胞純度達到(87.6±4.3)%，Vδ2 T細胞比例約為(84.6±3.1)%。以上結果提示γδT 細胞培養成功，而且以Vδ2 T細胞為主可用于后續實驗。

2.2AR-A014418對γδT細胞增殖的影響 CFSE 是一種可對活細胞進行熒光標記的細胞染色試劑，CFSE 進入細胞后可以不可逆地與細胞內的氨基結合偶聯到細胞蛋白質上。在細胞分裂增殖過程中，CFSE 標記熒光可平均分配至兩個子代細胞中，因此其熒光強度是親代細胞的一半。流式細胞術檢測結果如圖3A、 B顯示AR-A014418濃度在0.3～3 μmol/L 范圍內能顯著促進γδT細胞的增殖，其中3 μmol/L 時增殖率最大 (P<0.05,P<0.01)，而當濃度大于3 μmol/L后γδT細胞增殖率又降低。細胞計數儀計數結果也同樣顯示AR-A014418在3 μmol/L時γδT細胞數由對照組的(3.18±0.12)×106個升高到(4.21±0.26)×106個(P<0.05,P<0.01)(圖3C)。另外，如圖3D所示AR-A014418對γδT細胞亞群的改變沒有明顯變化。

圖2 γδT細胞鑒定Fig.2 Identification of γδT cells

2.3AR-A014418對γδT細胞凋亡的影響 培養10 d后的γδT細胞再經AR-A014418處理72 h后，經Annexin V-FITC /7-AAD雙染后，流式細胞術檢測結果如圖4A、B所示，對照組γδT細胞凋亡率為(25.14±1.94)%，而經0.3、1、3和10 μmol/L的AR-A014418處理后，細胞凋亡率分別為：(21.08±1.37)%、(18.38±2.83)%、(16.01±2.33)%和(22.57±1.89)%。以上結果表明AR-A014418體外可以抑制γδT細胞的凋亡(P<0.05,P<0.01)。同時，經0.3、1、3和10 μmol/L的AR-A014418處理72 h后，蛋白水平檢測顯示，促凋亡蛋白Cleaved caspase-3和Bax表達量逐漸減弱，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達量逐漸增強(圖4C)。

2.4AR-A014418對γδT細胞殺傷人腫瘤細胞活性的影響 根據以上實驗結果顯示，3 μmol/L的AR-A014418促進γδT細胞增殖且抑制其凋亡結果最顯著。因此我們選擇3 μmol/L的AR-A014418處理72 h 后的γδT細胞作為效應細胞，以人肝癌HepG2細胞和人胃癌SGC-7901細胞作為靶細胞，按照效靶比分別為10∶1和20∶1進行體外殺傷實驗檢測。流式細胞術檢測結果如圖5A、B所示，與對照組相比，3 μmol/L AR-A014418處理后的γδT細胞對人肝癌HepG2細胞殺傷效率 (18.01±2.04)% vs (33.8±3.41)%和(36.03±2.76)% vs (57.82±4.15)%顯著提高(P<0.01)；對人胃癌SGC-7901細胞殺傷效率 (27.30±1.70)% vs (42.43±3.93)% 和(46.82±4.61)% vs (71.67±5.27)%顯著提高(P<0.05,P<0.01)。以上結果顯示AR-A014418可以增強γδT細胞的體外殺傷腫瘤活性。

圖3 AR-A014418對γδT細胞增殖的影響Fig.3 Effect of AR-A014418 on growth of γδT cellsNote: *.P<0.05；**.P<0.01.

圖4 AR-A014418對γδT細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of AR-A014418 on apoptosis of γδT cellsNote: *.P<0.05；**.P<0.01.

圖5 AR-A014418處理后的γδT細胞對人肝癌HepG2細胞和人胃癌SGC-7901細胞的殺傷效應Fig.5 Killing activities of γδT cells treated with AR-A014418 against HepG2 and SGC-7901 cells

3 討論

γδT細胞是T淋巴細胞中表達γδTCR的一個亞群，是近年來研究較多的抗腫瘤免疫效應細胞之一，主要以MHC非限制性方式識別腫瘤抗原從而發揮殺傷作用[10]。目前體外常規擴增的γδT細胞已經用于多種腫瘤的治療，并取得較好的療效[11,12]。為了提高γδT細胞治療腫瘤效果，目前國內外研究主要集中于通過多種細胞因子和藥物等進行誘導培養γδT細胞及條件優化，來提高γδT細胞的體外增殖倍數及殺傷功能[8,13-16]。本實驗結果顯示，AR-A014418在0.3～3 μmol/L濃度范圍時不僅能促進體外γδT細胞的增殖，而且還能抑制其凋亡，尤其在3 μmol/L效果最為顯著。另外在3 μmol/L時AR-A014418還能增強γδT細胞的體外殺傷人肝癌HepG2細胞和人胃癌SGC-7901細胞活性。提示AR-A014418可以提高體外培養γδT細胞的數量和功能，為今后體外擴增γδT細胞用于腫瘤患者細胞免疫治療提供了實驗依據。

糖原合酶激酶-3β (Glycogen synthase kinase -3β，GSK-3β)是Wnt/β-catenin信號通路的負向調節激酶，是藥物篩選的重要靶點。目前針對該靶點的靶向藥物Lithium和Valproic acid已獲批分別用于治療抑郁癥和癲癇??；Flavopiridol 和Staurosporine 用于晚期實體瘤和血液病的治療已經進入臨床Ⅱ期[17]。我們前期實驗發現GSK-3β抑制劑TWS119在體外可以增強γδT細胞的增殖和腫瘤殺傷活性[7,8]。本研究發現GSK-3β另一抑制劑AR-A014418也具有類似功能，提示我們GSK-3β可能成為今后體外擴增γδT細胞的有效靶點。

綜上所述，GSK-3β抑制劑AR-A014418在3 μmol/L 濃度時，可以抑制體外擴增γδT細胞的凋亡，并且還能增強其體外增殖和殺傷腫瘤活性。結合前期研究和上述結論說明GSK-3β可能成為今后體外擴增γδT細胞的有效靶點，以及GSK-3β抑制劑AR-A014418具有一定的免疫調節功能，為今后的臨床應用提供實驗依據。