Alpha-熊果苷激活凋亡信號通路對人急性T細胞白血病細胞TIB-152異常增殖的調節作用①

字友梅 黃 琰 郭 燕 張 媛 王莉華 呂國慶 吳 隼

(新鄉醫學院第一附屬醫院血液一病區，衛輝453100)

白血病是一類骨髓中造血干細胞克隆增殖性疾病，常會出現細胞增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等。白血病包括四種亞型：急性淋巴細胞性、急性髓細胞性、慢性淋巴細胞性和慢性骨髓性[1]。據統計2012年全世界白血病新增病例35.2萬，占所有癌癥病例的2.5%，居第11位；死亡病例26.5萬，占所有癌癥死亡病例的3.2%，居第10位[2]。白血病是中國十大癌癥之一，2012年白血病死亡病例5.2萬，占全球白血病死亡病例的19.7%[3]。白血病的治療是一個亟待解決的重要醫學問題。研究表明許多草藥及植物果實有利于白血病的治療[4]。熊果苷(對-羥基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷)是一種天然的多酚類物質，屬于氫醌葡萄糖苷化合物，具有2種異構體即alpha-熊果苷和beta-熊果苷，首先發現于熊果干燥的葉子中，是常見的黑色素合成抑制劑，在化妝品行業被廣泛用作美白成分[5]。除此之外熊果苷還有許多其他的功能，例如殺菌，抗炎等[6]。但alpha-熊果苷在白血病中的作用研究還很缺乏。本研究的主要目的是探究alpha-熊果苷對人急性T細胞白血病細胞TIB-152增殖和凋亡的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1細胞系與主要試劑 急性淋巴細胞白血病細胞系TIB-152購自美國典型培養物保藏中心 (American Type Culture Collection,ATCC)。Alpha-熊果苷(分析純)購自Sigma公司。培養基RPMI1640和胎牛血清購自賽默飛世爾科技公司。CCK-8試劑盒來源于日本同仁化學公司。細胞凋亡檢測試劑盒Annexin V Apoptosis Detection Kit購自美國BD公司。抗B細胞淋巴瘤2(B cell lymphoma 2,Bcl 2)抗體，抗Bcl 2相關蛋白X (Bcl-2-associated X protein,Bax)抗體，抗 Cleaved caspase-3抗體和抗Cleaved caspase-9抗體購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養與藥物處理 TIB-152細胞于添加了10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI1640培養基中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養。當細胞增殖到約80%時進行傳代。用不同濃度(0、 0.1、 0.2、 0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500 μmol/L)的alpha-熊果苷處理TIB-152細胞48 h后通過CCK-8檢測細胞毒性。后續實驗TIB-152細胞分為4組：TIB-152 (對照組)；alpha-熊果苷(10、20、50 μmol/L)組。

1.2.2CCK-8檢測細胞增殖 用10、20、50 μmol/L的alpha-熊果苷處理TIB-152細胞后，每天檢測各組細胞的增殖倍數。首先用培養基將CCK-8溶液稀釋到10%，再用上述溶液制成1×106個/ml的細胞懸液；然后于37℃恒溫培養箱中培養4 h，最后檢測450 nm處吸光值，計算細胞增殖倍數。

1.2.3流式細胞術分析細胞凋亡 用10、20、50 μmol/L的alpha-熊果苷處理TIB-152細胞48 h后檢測細胞凋亡率。首先1×的Binding buffer將待測細胞制成1×106個/ml的懸液。然后用Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)，碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色15 min，最后利用流式細胞儀對染色的細胞進行檢測，計算細胞凋亡率。

1.2.4蛋白印跡 在10、20、50 μmol/L的alpha-熊果苷處理TIB-152細胞48 h后，首先用PBS將待測細胞清洗3次，再入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，100℃變性5 min。等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉至PVDF膜，然后用5%的BSA封閉1 h，再加入相應的一抗，4℃過夜孵育，第2天加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照并統計灰度值計算相對表達量。

1.3統計學分析 用SPSS16.0軟件進行統計學分析，兩兩比較用獨立的t檢驗。P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1Alpha-熊果苷對TIB-152的細胞毒性檢測 通過CCK-8檢測不同濃度alpha-熊果苷處理TIB-152后的細胞活力，分析alpha-熊果苷對TIB-152的細胞毒性。圖1B顯示，當alpha-熊果苷處理濃度<50 μmol/L 時，TIB-152的細胞活力可維持在80%以上，未產生明顯的細胞毒性；但當alpha-熊果苷處理濃度>50 μmol/L時，TIB-152的細胞活力急劇下降，均在80%以下。由此可見，<50 μmol/L的alpha-熊果苷對TIB-152沒有明顯的細胞毒性，>50 μmol/L的alpha-熊果苷會對TIB-152產生細胞毒性。

2.2Alpha-熊果苷對TIB-152細胞增殖的影響 為分析alpha-熊果苷對TIB-152細胞增殖的影響，利用CCK-8檢測細胞增殖倍數。如圖2所示，10 μmol/L的alpha-熊果苷組與對照組細胞增殖倍數無明顯變化。與對照組相比，50 μmol/L的alpha-熊果苷組細胞增殖倍數明顯降低(P<0.01)。以上結果說明，alpha-熊果苷可減弱TIB-152細胞增殖。

圖1 Alpha-熊果苷化學結構式(A)和alpha-熊果苷對TIB-152 (B)和正常的PBMC (C)細胞活力的影響Fig.1 Chemical structure of alpha-Arbutin (A) and effect of alpha-Arbutin on cell viability of TIB-152 (B)and normal PBMC cells (C)

圖2 CCK-8檢測細胞增殖Fig.2 Proliferation was detected by CCK-8Note: **.P<0.01 vs.control group.

圖3 流式細胞術檢測細胞凋亡Fig.3 Apoptosis was detected by flow cytometryNote: A.Scatter diagram of flow cytometry；B.Histogram of flow cytometry，**.P<0.01 vs.control group.

圖4 蛋白印跡檢測Bax和Bcl-2表達Fig.4 Expression of Bax and Bcl-2 was tested by Western blotNote: A.Representative graph of Western blot；B.Histogram of Western blot.**.P<0.01 vs control group.

圖5 蛋白印跡檢測Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達Fig.5 Expression of Cleaved caspase-3 and Cleaved caspase-9 was measured by Western blotNote: A.Representative graph of Western blot；B.Histogram of Western blot.**.P<0.01 vs.control group.

2.3Alpha-熊果苷對TIB-152細胞凋亡的影響 通過流式細胞術檢測細胞凋亡率，分析alpha-熊果苷對TIB-152細胞凋亡的影響。由圖3可知，50 μmol/L的alpha-熊果苷組細胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.01)。上述結果表明，alpha-熊果苷可增強TIB-152細胞凋亡。

2.4Alpha-熊果苷對TIB-152細胞Bax/Bcl-2 表達的影響 利用蛋白印跡檢測Bax和Bcl-2表達，分析alpha-熊果苷對TIB-152細胞Bax/Bcl-2 蛋白比值的影響。圖4顯示，50 μmol/L的alpha-熊果苷組Bax/Bcl-2比值顯著高于對照組(P<0.01)。由此可見，alpha-熊果苷可提高TIB-152細胞Bax/Bcl-2 蛋白比值。

2.5Alpha-熊果苷對TIB-152細胞Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達的影響 通過蛋白印跡分析alpha-熊果苷對TIB-152細胞Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達的影響。如圖5所示，50 μmol/L的alpha-熊果苷組Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達顯著高于對照組(P<0.01)。以上結果說明，alpha-熊果苷可上調TIB-152細胞Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達。

3 討論

目前對T細胞白血病的主要治療方法包括：化療、造血干細胞移植、免疫療法、分子靶向治療等[7]。但這些方法都存在一些缺陷，挖掘新的白血病治療藥物具有重要意義。大量文獻報道植物提取物在各類疾病治療中具有積極作用[8-10]。

細胞增殖的不受控是癌細胞的普遍特征。研究表明許多植物提取物都可調控癌細胞的增殖。有數據顯示梓醇(一種環烯醚萜葡萄糖苷化合物)具有抑制卵巢癌細胞及乳腺癌細胞增殖的功效[11,12]。有研究發現在白血病HL60細胞中，沙棘提取物可抑制細胞增殖[13]。據報道肉桂葉提取物可減弱白血病細胞THP-1增殖[14]。熊果苷是目前美白化妝品的主要原料，質量濃度一般在0.07～50 mg/L。近年來還發現熊果苷對癌癥的治療也具有積極作用。有數據表明熊果苷可抑制膀胱癌細胞增殖[15]。本文結果顯示，alpha-熊果苷可明顯減弱人急性T細胞白血病TIB-152細胞增殖。

細胞凋亡的受阻是癌癥的主要特征之一。越來越多的研究表明植物提取物在抗癌細胞凋亡方面發揮著積極作用。有數據顯示大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷可提高卵巢癌細胞凋亡[16]。Jin等[17]發現梓醇可促進膀胱癌細胞凋亡。據報道TIB-152細胞中，百足草提取物可誘導細胞凋亡[18]。有研究發現白花蛇舌草提取物可誘導白血病HL60細胞凋亡[19]。據報道熊果苷可促進B16黑色素瘤細胞凋亡[20]。本研究結果顯示，alpha-熊果苷可增強TIB-152細胞凋亡。但有研究顯示熊果苷有保護U937淋巴瘤細胞免于電離輻射誘導的凋亡的作用[21]。這可能是由于熊果苷存在2種同分異構體：α型和β型，這2種同分異構體的不僅在物理化學性質方面存在一定的差異，在功能方面也存在差異[22-24]。另一方面可能是由于作用的時間、濃度、細胞系及細胞所處的環境的不同造成的。

在線粒體介導的細胞凋亡信號通路中Bax、Bcl-2、Caspase-9和Caspase-3都是關鍵性因子[25]。許多植物提取物可影響這些細胞凋亡信號通路相關蛋白的表達。有研究發現黃柏酮葡萄糖苷及槲皮素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷均可提高前列腺癌細胞Bax/Bcl-2 蛋白比值，增強Caspase-3表達[26,27]。據報道茯苓提取物可提高白血病U937細胞Bax/Bcl-2 蛋白比值，上調Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9表達[28]。Sung等[29]發現緊密小鷹芹提取物可提高白血病HL60細胞Bax/Bcl-2 蛋白比值，增強Caspase-3和Caspase-9表達。本文結果顯示，alpha-熊果苷可提高TIB-152細胞Bax/Bcl-2 蛋白比值，上調Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達。

本研究表明，在人急性T細胞白血病TIB-152細胞中，alpha-熊果苷可抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，提高Bax/Bcl-2 蛋白比值，增強Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達。綜上所述，alpha-熊果苷可激活凋亡信號通路抑制人急性T細胞白血病細胞TIB-152細胞增殖，促進細胞凋亡。下一步計劃進行體內實驗研究alpha-熊果苷對急性T細胞白血病發生發展的影響。