神經節苷脂GD3合酶缺失加重DSS誘導的小鼠炎癥性腸病①

閆風連 董冠軍 張 惠 張俊鳳 史 慧 寧召臣 李春霞 朱玉貞 姚瀟穎 李學慧 王玉忠 司傳平 熊化保

(濟寧醫學院免疫學與分子醫學研究所，濟寧272067)

炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一種慢性易復發的胃腸紊亂疾病，由兩種主要亞型組成：潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn′s disease，CD)[1]。UC主要影響結腸，其特征是在黏膜以及黏膜下層產生炎癥。 CD是一種透壁性的炎癥，對從口腔到肛門的整個消化道都可能產生影響[1]。IBD最初主要在北美和歐洲一些發達國家高發，最近一些年在亞洲其發病率也持續增高[2,3]。目前普遍認為IBD的發生與環境、遺傳、腸道微生物以及免疫等多方面因素的相互作用密切相關[2,4,5]。但其具體的發病機制尚不清楚。

神經節苷脂是一類非常重要的含有唾液酸的鞘糖脂，廣泛分布于細胞的外表面，在腦組織中含量豐富[6]。GD2和GD3分別是含有兩個糖基和三個糖基的雙唾液酸神經節苷脂，在正常人的組織中不表達，或者低水平表達，一般只有在病態下才高水平表達，例如癌癥以及神經退行性疾病等[6]。GD3和GD2在腫瘤的增殖、遷移、侵襲、黏附、血管生成以及腫瘤的免疫抑制中發揮著重要作用[6]。GD3合酶(GD3 synthase，GD3S)是一種調控GD3和GD2合成的酶，在腫瘤的發生發展以及神經退行性疾病中具有重要作用[6,7]。目前以GD3合酶為藥物靶點開發治療腫瘤新藥具有廣闊前景。有研究表明，具有炎癥的腸黏膜中GD3的含量比正常腸黏膜要低，而且通過飲食在結腸細胞中增加神經節苷脂的含量可以降低促炎細胞因子信號通路[8]，在培養的嬰兒結腸中可以阻止低氧誘導的腸壞死以及細胞損傷[9]。但是具體的有關GD3合酶是否直接參與IBD還鮮有報道。因此本研究選擇利用經典小鼠IBD模型以及GD3合酶缺陷小鼠來探索GD3合酶是否參與IBD以及在其中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑 C57BL/6小鼠購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司；神經節苷脂GD3合酶缺失小鼠(GD3S-/-)由濟寧醫學院附屬醫院王玉忠副主任提供，繁殖并飼養于本實驗室SPF級動物房。DSS購自MP Biomedicals公司；IL-6 ELISA檢測試劑盒購自BioLegend公司；結腸組織病理切片由濟南金域醫學檢驗中心有限公司制備；RIPA強裂解液、BCA檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；TUNEL凋亡檢測試劑盒購自Roche公司。酶聯免疫檢測儀購自BIOTEK公司；倒置熒光顯微鏡Ti-E購自日本NIKON公司；臺式高速冷凍離心機Multifuge×1R購自ThermoFisher公司。

1.2方法

1.2.1小鼠IBD模型死亡率檢測 于濟南朋悅購買6周雄性C57BL/6小鼠，在本實驗室SPF級動物房內適應1周，GD3S-/-小鼠繁殖并飼養于本實驗室SPF級動物房，飼養至7周，與C57BL/6小鼠同時開始建立DSS誘導的小鼠IBD模型。實驗分為兩組：C57BL/6 DSS模型組(WT DSS組)以及GD3S-/-DSS模型組(GD3S-/-DSS組)，各8只小鼠。兩組小鼠均給予2.5%的DSS飲水，每天記錄小鼠死亡數量，并繪制小鼠生存率曲線。

1.2.2小鼠IBD模型分組與樣品采集 實驗分為4組：C57BL/6對照組(WT組)、C57BL/6 DSS模型組(WT DSS組)、GD3S-/-對照組(GD3S-/-組)、GD3S-/-DSS模型組(GD3S-/-DSS組)。DSS模型組給予2.5%DSS飲水7 d、對照組給予正常飲水7 d，期間每天記錄小鼠體重變化以及便血情況。7 d 后眼球取血，4 500 r/min離心10 min收集小鼠血清。解剖分離小鼠全結腸，測量結腸長度。將結腸內容物用醫用棉簽處理干凈后備用。

1.2.3腸蛋白的提取及濃度測定 取結腸近肛門端2 cm結腸，加入1 ml RIPA強裂解液，用勻漿器進行勻漿，然后4℃靜置裂解2 h，每15 min上下顛倒混勻，4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清。嚴格按照碧云天生物技術有限公司BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書中操作步驟，檢測各樣品的蛋白濃度。

1.2.4腸勻漿上清以及血清中IL-6蛋白表達水平檢測 包被：加入100 μl稀釋好的 IL-6的包被抗體，在2～8℃包被過夜；封閉：用配好的清洗液洗板4次，加入200 μl assay diluent 在微孔板振蕩器上室溫孵育1 h；加樣：洗板4次，加入100 μl稀釋好的標準品以及樣品，在微孔板振蕩器上室溫孵育2 h；加檢測抗體：洗板4次，加入100 μl稀釋好的檢測抗體，在微孔板振蕩器上室溫孵育1 h；加酶：洗板4次，加入100 μl稀釋好的Avidin-HRP，在微孔板振蕩器上室溫孵育30 min；顯色：加入清洗液微孔板振蕩器上振蕩1 min后棄去孔內液體，清洗5次，加入100 μl TMB，室溫避光孵育 15～30 min，根據孔內顏色的深淺(深藍色)來判定；終止反應：迅速加入100 μl 終止液終止反應；讀板：終止后15 min內，用檢測波長450 nm 讀值。

1.2.5TUNEL法檢測細胞凋亡 結腸組織石蠟包埋切片，65～70℃脫蠟2 h；將組織切片置于染色缸中，用二甲苯洗2次，每次10 min；用無水乙醇洗2次，每次5 min。用95%、90%、85%、80%、75%乙醇各洗1次，每次3 min；用PBS于脫色搖床上洗2次，每次5 min；加入200 μg/ml蛋白酶K工作液于20～37℃水解 30 min，去除組織蛋白；用PBS于脫色搖床上洗3次，每次5 min；滴加試劑盒內的TUNEL檢測液；將切片放于濕盒內37℃避光孵育1 h；用PBS于脫色搖床上避光清洗3次，每次5 min；擦凈玻片，滴加防淬滅劑；封片。

1.3統計學處理 統計學分析實驗數據應用GraphPad prism 6軟件分析處理，兩組之間比較采用非配對t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1GD3S缺失導致IBD模型小鼠生存率降低 與WT小鼠相比，GD3S-/-小鼠在給予2.5%DSS飲水第12天時全部死亡，而WT小鼠在建模16 d后仍有一半小鼠存活，經統計學分析顯示其生存率差異有統計學意義(P<0.05，圖1)，說明神經節苷脂GD3或GD2在DSS誘導的IBD小鼠中具有一定的保護作用。

2.2GD3S缺失加重IBD模型小鼠的炎癥表型 DSS誘導的IBD小鼠模型的典型特征是在飲用2%～5% DSS 5～7 d后出現便血、體重減輕，結腸長度變短的現象[10]。因此分別給予WT小鼠以及GD3S-/-小鼠2.5%DSS飲水7 d，期間每天記錄小鼠體重變化以及便血情況，并檢測7 d后其結腸長度。結果顯示GD3S-/-小鼠在第5天時出現血便，而WT小鼠明顯晚于GD3S-/-小鼠。且與WT小鼠相比，GD3S-/-小鼠其體重下降更快，在第4天時與對照組相比即有極顯著差異(P<0.01，圖2A)。GD3S-/-小鼠其結腸長度也顯著短于野生型小鼠(P<0.01，圖2B、C)。

2.3GD3S缺失加重IBD模型小鼠結腸黏膜的損傷 DSS誘導的IBD小鼠在建模6～10 d時結腸黏膜結構會出現明顯潰瘍，表現為緊密排列的單層管狀細胞、隱窩層和扁平上皮層，逐漸出現肌層變厚，隱窩被中性粒細胞滲透，出現上皮層細胞大量死亡，隱窩結構消失且伴隨大量炎癥細胞的浸潤[11]。通過HE染色以及TUNEL法分別觀察WT小鼠以及GD3S-/-小鼠結腸黏膜損傷以及細胞死亡情況。HE染色結果顯示GD3S-/-小鼠已無緊密排列的單層管狀細胞，而且炎癥細胞浸潤更為嚴重。TUNEL結果顯示GD3S-/-小鼠凋亡細胞明顯增多。

圖1 神經節苷脂GD3合酶缺失降低IBD模型小鼠生存率Fig.1 Ganglioside GD3 Synthase deficiency decreased survival rate of IBD mouseNote: Kaplan-Meier method was used to estimate overall survival and the survival rates were determined by Log-rank test.Compared to WT DSS group，*.P<0.05.

2.4GD3S缺失使IBD模型小鼠炎性因子的分泌增加 DSS誘導的IBD的發生發展伴隨著大量炎性因子的釋放，結腸組織中炎性因子的表達水平也能反映結腸炎癥的狀態。檢測了WT小鼠以及GD3S-/-小鼠血清和結腸組織勻漿中IL-6的表達，結果顯示GD3S-/-小鼠血清以及結腸組織勻漿中IL-6的表達明顯升高，與WT組相比具有極顯著差異(P<0.01，圖4A、B)。

圖2 GD3S缺失加重IBD模型小鼠的炎癥表型Fig.2 Ganglioside GD3 Synthase deficiency aggravated dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitisNote: A.Loss of basal body weight of WT and GD3S-/-mice;B.Colon length of WT and GD3S-/-mice;C.The statistical result of Colon length.Compared to WT DSS group，**.P<0.01.

圖3 GD3S缺失加重IBD模型小鼠結腸黏膜的損傷(HE，TUNEL,×200)Fig.3 Ganglioside GD3 Synthase deficiency increased pathological damage of colonic mucosa in inflammatory bowel disease(HE，TUNEL,×200)Note: HE (above) and TUNEL(below) methods were used to detect the pathological damage of colonic mucosa.

圖4 GD3S缺失使IBD模型小鼠炎性因子的分泌增加Fig.4 Increased inflammatory cytokine production of Ganglioside GD3 Synthase deficiency mice in inflammatory bowel diseaseNote: A.Cytokine level in blood serum of WT and GD3S-/-mice；B.Cytokine level in colonic homogenate of WT and GD3S-/-mice.Compare to WT DSS group，**.P<0.01.

3 討論

IBD是一種由環境、基因、免疫等多種因素相互作用導致的疾病。IBD患者會有規律地出現慢性炎癥、過度活化的免疫應答、腸結構損傷、滲透性改變等癥狀，對于患者的生活質量具有很大的影響。目前主要通過類固醇類、免疫抑制劑類或抗生素等一些昂貴的藥物來控制該疾病，嚴重者需要進行手術去除病變的結腸，但是這些手段均不能使該疾病完全治愈[12]。因此目前急需一種新的治療方式來解決這一問題。神經節苷脂對于細胞膜結構和功能的完整性具有重要作用，是小腸紋狀緣細胞以及結腸頂端表面細胞的組成成分，可以影響到多種細胞進程，包括微生物附著、細胞分裂、分化以及信號通路[13]。有研究表示神經節苷脂在腸黏膜中的新陳代謝可能是IBD發病的基礎[14]。在腸黏膜中神經節苷脂含量較低，往往會伴隨著炎癥標志分子表達增加、容易感染致病菌、腸完整性被破壞等[13]。GD3、GD2作為神經節苷脂中的重要一員，目前其研究主要集中于對各種腫瘤以及神經退行性疾病的影響[6]，在IBD中的作用還很少有報道，有報道指出IBD患者腸黏膜中GD3含量降低[14]，但是具體GD3是否參與IBD的發生發展，還是IBD導致GD3含量的降低目前均還不清楚。GD3S是唯一的調控GD3和GD2合成的酶，已被認為是癌癥治療藥物新的靶點[6]，因此通過研究GD3S在IBD中的作用，可以為GD3、GD2是否參與IBD提供直接依據，也為IBD的治療提供新的研究方向以及實驗依據。

我們利用GD3S缺失小鼠，誘導IBD模型，發現GD3S-/-DSS模型組與WT DSS組相比，其生存率顯著降低，體重下降明顯加快，血便早于WT DSS組；結腸長度也顯著短于WT DSS組；HE染色顯示GD3S-/-DSS模型組結腸黏膜組織損傷較重，TUNEL染色顯示GD3S-/-DSS模型組凋亡細胞顯著增加；GD3S-/-DSS模型組血清以及結腸黏膜組織勻漿IL-6表達明顯高于WT DSS。說明GD3S缺失會加重DSS誘導的IBD，GD3、GD2在IBD的發生發展中具有重要作用。但是GD3、GD2參與IBD的具體機制還未有報道，仍需進一步的研究。

目前已知的GD3可能參與IBD的機制包括以下幾方面：①通過間接影響整合素進而影響免疫細胞向腸道的募集。趨化因子受體9可以使免疫細胞募集于腸道，但趨化因子9受體陽性免疫細胞主要分布在小腸，而整合素α4β7陽性的免疫細胞傾向于募集在小腸以及結腸[13]，GD3可以和β1整合素聚集影響整合素介導的信號通路[15]，這就提示GD3有可能通過影響整合素進而影響免疫細胞向腸道的募集。②影響NF-κB信號通路。CARD15[Nucleotideoligomerization domain-containing protein 2 (NOD2)]被認為是CD的一種遺傳風險因子，CARD15 缺陷會導致NF-κB 持續激活，引發慢性炎癥以及腸黏膜損傷[13]。GD3可以抑制有絲分裂原激活的T細胞中NF-κB 的激活[16]。NF-κB 的激活會促進環氧酶(Cyclooxygenase，COX) 以及脂氧合酶(Lipoxygenase，LOX)增加，促進花生四烯酸向促炎介質白三烯B4以及前列腺素E2的轉化，進而促進炎癥。說明GD3有可能通過NF-κB信號通路影響IBD。③影響腸黏膜通透性以及完整性。 腸黏膜的通透性是由緊密接頭蛋白介導的，它主要位于脂筏上[17]。在腸黏膜中GD3含量低會導致緊密接頭蛋白的降解，增加腸黏膜中GD3含量可以減少接頭蛋白的降解從而減少腸黏膜滲透性、改善腸結構的完整性[14]。這些都為后續研究提供了一定的方向。

綜上所述，GD3S缺失會加重DSS誘導的炎癥性腸病，為GD3、GD2在炎癥性腸病的發生發展中具有重要作用提供了實驗依據，雖然其具體機制仍然需要進一步深入研究，但是也為IBD的治療提供了新的方向。