歸芪白術方對順鉑所致小鼠腎臟損傷的減毒作用

王磊，許小敏，張艷輝，劉永琦，張利英，張麗昕，張苡銘，何進鵬，危文俊

化學療法能夠有效抑制腫瘤細胞的增殖和轉移，然而化療后患者的5年存活率并未得到明顯的提高，因為化療藥在殺死腫瘤細胞的同時對其他正常的組織細胞也存在著殺傷作用。研究表明，化療藥的主要毒副作用包括免疫功能下降、炎癥反應、肝腎毒性、神經毒性、靜脈炎等[1-2]。因此，如何降低化療藥的毒副作用成為發展化學療法必須解決的關鍵難題。腎毒性是化療藥最常見的毒副作用，也是對機體損害較嚴重的毒副作用[3]，探索與研究降低化療藥腎臟毒性的藥物具有非常重要的意義。從中醫病因上來說，化療藥的毒副作用屬于藥毒致病的范疇，在致病機制上常表現為各種臟腑的毒性損害或功能異常，因此在治療和預防上應當以扶正解毒、調理臟腑功能為主要治則治法[4-6]。歸芪白術方由黃芪、當歸、白術、大黃、白芍、陳皮、炙甘草等中藥組成，具有益氣健脾、活血解毒、補血柔肝等功效，因此在理論上能夠有效減輕化療藥物引起的毒副作用。本研究從順鉑引起的腎臟損傷方面來探索歸芪白術方對化療藥毒副作用的減毒作用，以期為臨床上防治化療藥的毒副作用提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 實驗藥物 歸芪白術方中藥飲片免煎顆粒(黃芪12g、當歸6g、白術6g、大黃4g、白芍9g、陳皮4g、炙甘草6g)購自甘肅中醫藥大學附屬醫院，開水沖散后，于酒精爐上再煮沸5min，每味飲片按小鼠與成人的用量換算系數同比換算成小鼠的用量，并分為歸芪白術方低劑量組(1/2正常用量)、中劑量(正常用量)和高劑量(2倍正常用量)。

1.1.2 實驗動物 SPF級雄性昆明小鼠50只，體重20±2g。由中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供，動物許可證號：SCXK(甘)2015-0001。

1.1.3 主要試劑和儀器 蛋白裂解液(貨號P0013C)、β巰基乙醇(貨號P0013C)、聚丙烯酰胺凝膠試劑盒(貨號P0013C)、過硫酰胺(貨號P0013C)、TEMED(貨號P0013C，上海碧云天生物技術有限公司)；抗caspase 3抗體(貨號ab13847)、抗caspase 9抗體(貨號ab202068，Abcam公司)；山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶標記(貨號123450，北京中杉金橋生物技術有限公司)；4%多聚甲醛(貨號P1110，北京索萊寶公司)。分析天平(型號TEZ101-L，德國Sartorius公司)、臺式離心機(型號TDL-5-A，中國Thermo Fisher公司)、分光光度計(型號VIS-723N，北京瑞利分析儀器公司)、移液器(型號2.5、20、100、1000μl，美國Eppendorf公司)、倒置顯微鏡(型號DMIL-BFC295，德國Leica公司)，血球分析儀(型號CS1000i，日本Sysmex公司)、血清生化分析儀(型號Cabas8000，瑞士Roche公司)、電泳儀(型號EPS30，上海Biotech公司)，轉膜儀(型號Power pachc，上海Bio-Rad公司)、曝光儀(型號10U，美國Kodak公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 將50只雄性昆明小鼠隨機分為5組：空白組，模型組及歸芪白術方低、中、高劑量組，每組10只。模型組，歸芪白術方低、中、高劑量組每7d腹腔注射一次順鉑(劑量2.0mg/kg，每次0.2ml)，共注射4次；空白組每7d注射一次生理鹽水(劑量2.0mg/kg，每次0.2ml)，共注射4次。歸芪白術方低、中、高劑量組每日17:00均干預1次，每次灌胃0.4ml，空白組與模型組每日17:00用等量生理鹽水灌胃。各組小鼠每2d測量一次體重，每4d測量一次飲食情況，末次干預后48h收集血液樣本，腎臟大體形態拍照后固定、凍存腎臟組織樣本。

1.2.2 記錄、分析小鼠體重和飲食的變化情況 將每2d測得的各組小鼠體重按每組的平均體重進行統計分析，共分析了12個時間點的體重變化，并繪制體重變化曲線；將每4d測得的飲食量按每組的平均飲食量進行統計分析，共分析6個時間點的飲食量變化，并繪制飲食量變化曲線。

1.2.3 腎臟大體形態觀察 剝離各組小鼠腎臟，生理鹽水洗凈，濾紙吸干液體，按不同的分組分別置于一張白色的A4紙上，照相機拍照記錄各組小鼠腎臟大體形態，每組均分析10只小鼠，每只小鼠取一個腎臟進行觀察。

1.2.4 各組小鼠血常規的檢測 每只小鼠收集200μl血液加入有抗凝劑的EP管中，采用血球分析儀檢測各組小鼠的血常規。

1.2.5 各組小鼠腎臟指數及腎臟功能的檢測 稱量各組小鼠腎臟質量，腎臟指數=腎臟質量(mg)/大鼠的體重(g)。收集各組小鼠剩余的所有血液，離心后吸取血清，血清生化分析儀檢測各組小鼠的腎臟功能。

1.2.6 各組小鼠腎臟病理形態的觀察 HE染色觀察腎臟組織病理學變化，每張玻片選取3個清晰度較好的視野進行腎臟組織病理評分。評分原則：0分，腎臟組織結構正常，無明顯變性、壞死及炎性浸潤，腎小管結構清晰；1分，腎臟組織結構較正常，可見到輕微的變性、壞死、炎性浸潤，腎小管結構較清晰；2分，腎臟組織結構改變明顯，可見到較多的變性、壞死、炎性浸潤，腎小管結構模糊；3分，腎臟組織結構明顯異常，可見明顯的變性、壞死、炎性浸潤，腎小管結構模糊[7]。

1.2.7 各組小鼠腎臟組織中caspase 3、caspase 9表達量的檢測 取100mg腎臟組織加入400μl蛋白裂解液，在冰盒上充分研磨后靜置20min，充分裂解腎臟組織中的蛋白。4℃、12 000r/min離心10min，吸取上清，測量并調整蛋白濃度一致后，按1:5的比例加入上樣緩沖液，98℃金屬浴煮10min后，放入–80℃冰箱備用。配制12%及5%的電泳凝膠，每組上樣量為10μl，80V和120V進行電泳分離蛋白；分離蛋白后用濕轉膜法轉膜100min，將轉膜后的PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉2h；用5%脫脂牛奶配置的caspase 3(1:1000)、caspase 9(1:1000)、GAPDH(1:4000)一抗孵育，并放置于4℃標本庫過夜；次日早上取出抗體，TBST洗滌3次，每次10min；用5%脫脂牛奶配制的山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶標記(1:4000)，室溫條件下孵育2h；TBST洗滌3次，每次10min，用ECL發光液顯影成像并洗出曝光的膠片；將GAPDH作為內參，并用Image J軟件分析蛋白灰度值，計算caspase 3、caspase 9在各組中的相對表達量。

1.3 統計學處理 采用SPSS 21.0軟件進行統計分析。所有數據以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠體重及飲食變化比較 空白組小鼠體重隨著時間延長而增加；模型組小鼠體重呈周期性的降低和恢復；歸芪白術方低、中、高各劑量組的這種周期性降低得到一定緩解，其中歸芪白術方中劑量組緩解情況最明顯。空白組小鼠飲食量維持在一個較高的平均水平；模型組小鼠飲食量明顯降低；與模型組比較，歸芪白術方低、中、高各劑量組飲食量降低的趨勢有所緩解，其中歸芪白術方中劑量組緩解情況較明顯，但整體仍然呈明顯降低的趨勢(圖1)。

圖1 各組小鼠體重(A)及飲食量(B)的變化情況Fig.1 Changes of weight (A) and food intake (B) in each group of mice

2.2 各組小鼠腎臟大體形態比較 腎臟大體形態觀察可見，空白組小鼠腎臟顏色深紅，富有血液；模型組小鼠腎臟顏色明顯變淺，體積明顯較空白組變小；與模型組比較，歸芪白術方低、中、高各劑量組腎臟外觀得到改善，顏色較模型組加深，其中歸芪白術方中、高劑量組改善較明顯，歸芪白術方低劑量組有輕微改善。

2.3 各組小鼠血常規比較 血常規結果顯示，與空白組比較，模型組小鼠白細胞(WBC)、血小板(PLT)明顯降低(P＜0.05)，而紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)無明顯變化；與模型組比較，歸芪白術方中、高劑量組WBC、PLT明顯升高(P＜0.05)，RBC、HGB的變化差異無統計學意義(表1)。

表1 各組小鼠血常規的變化情況(±s，n=10)Tab.1 Changes of blood routine in each group of mice (±s, n=10)

表1 各組小鼠血常規的變化情況(±s，n=10)Tab.1 Changes of blood routine in each group of mice (±s, n=10)

WBC. White blood cell; RBC. Red blood cell; HGB. Hemoglobin; PLT. Platelet; (1)P＜0.05 compared with control group; (2)P＜0.05 compared with model group; (3)P＜0.05 compared with Guiqi Baizhu prescription low dose group

WBC (109/L) RBC (1012/L) HGB (g/L) PLT (g/L)Control group 12.48±1.67 9.95±0.59 154.33±9.87 993.67±173.34 Model group 4.37±0.30(1) 9.31±0.69(1) 154.00±10.58(1) 629.67±134.11(1)Guiqi Baizhu prescription low dose group 5.06±1.62 9.40±0.49 153.00±11.53 809.33±62.31 Guiqi Baizhu prescription medium dose group 7.63±0.08(2)(3) 9.35±0.17(2)(3) 143.00±2.83(3) 889.50±81.32(3)Guiqi Baizhu prescription high dose group 7.46±1.46(2) 9.69±0.91(2) 152.67±9.87 918.00±49.37 F 131.812 5.182 8.703 25.639 P 0.000 0.001 0.000 0.000 Group

2.4 各組小鼠腎臟指數及腎臟功能比較 與空白組比較，模型組小鼠腎臟指數明顯降低(P＜0.05)；與模型組比較，歸芪白術方低、中、高劑量組小鼠腎臟指數明顯升高，其中歸芪白術方中、高劑量組差異有統計學意義(P＜0.05)。與空白組比較，模型組小鼠BUN、Scr含量明顯升高(P＜0.05)；與模型組比較，歸芪白術方低、中、高劑量組小鼠BUN含量均明顯降低，而Scr含量僅在歸芪白術方中、高劑量組差異有統計學意義(P＜0.05，表2)。

表2 各組小鼠腎臟指數及腎臟功能的變化情況(±s，n=10)Tab.2 Changes of renal index and renal function in each group of mice (±s, n=10)

表2 各組小鼠腎臟指數及腎臟功能的變化情況(±s，n=10)Tab.2 Changes of renal index and renal function in each group of mice (±s, n=10)

BUN. Blood urea nitrogen; Scr. Serum creatinine; (1)P＜0.05 compared with control group; (2)P＜0.05 compared with model group; (3)P＜0.05 compared with Guiqi Baizhu prescription low dose group

Renal index (mg/g) BUN (mmol/L) Scr (μmol/L)Control group 13.02±0.82 9.50±1.47 20.67±3.21 Model group 8.68±1.84(1) 13.10±0.79(1) 45.33±10.41(1)Guiqi Baizhu prescription low dose group 9.58±1.94 12.43±1.85(2) 40.00±7.00 Guiqi Baizhu prescription medium dose group 10.83±0.96(2)(3) 11.20±1.32(2)(3) 36.33±4.51(2)(3)Guiqi Baizhu prescription high dose group 11.05±0.60(2) 11.17±0.50(2) 23.33±2.52(2)F 47.410 41.075 54.697 P 0.000 0.000 0.000 Group

2.5 各組小鼠腎臟組織病理改變比較 HE染色可見，空白組小鼠腎臟組織結構正常，未見變性、壞死及炎性浸潤等，腎小管結構清晰可見，病理評分為(0.34±0.24)分；模型組小鼠腎臟組織結構明顯異常，腎小管結構濁腫，炎性細胞浸潤明顯，近曲小管上皮細胞可見較多的氣球樣變，部分萎縮或消失，病理評分為(2.07±0.49)分，與空白組比較，差異有統計學意義；歸芪白術方各劑量組小鼠腎臟組織病理損傷較模型組有所減輕，腎小管濁腫程度得到緩解，近曲小管上皮細胞氣球樣變、萎縮程度均得到改善，其中歸芪白術方低、中、高劑量組病理評分分別為(1.86±0.42)分、(1.34±0.28)分、(1.68±0.58)分，與模型組比較，中、高劑量組差異有統計學意義(圖2)。

圖2 各組小鼠腎臟組織病理學變化(HE ×20)Fig.2 Pathological changes of kidney tissues in each group of mice (HE ×20)

2.6 各組小鼠腎臟組織中caspase 3、caspase 9表達量比較 Western blotting結果顯示，與空白組比較，模型組小鼠腎臟組織中caspase 3、caspase 9的表達明顯上調(P＜0.05)；而與模型組比較，歸芪白術方各劑量組小鼠腎臟組織中caspase 3、caspase 9的表達量均下調；其中歸芪白術方中劑量組小鼠腎臟組織中caspase 3、caspase 9表達量的下調具有統計學意義(P＜0.05)，同時歸芪白術方低、高劑量組小鼠腎臟組織中caspase 3表達量的下調具有統計學意義(P＜0.05，圖3)。

圖3 各組小鼠腎臟組織中caspase 3、caspase 9的表達情況Fig.3 Expressions of caspase 3 and caspase 9 in kidney tissue of each group of mice

3 討 論

順鉑是腫瘤化療的常用藥物之一，能夠有效阻止癌細胞的增殖、浸潤、轉移，并最終殺滅癌細胞，然而順鉑在殺滅癌細胞的同時，也不可避免地會損傷人體正常細胞，從而出現藥物的副作用[8-10]。現代藥理學研究證實，化療后部分化療藥物廣泛分布于機體各組織器官并蓄積于腎臟組織，并且主要通過腎臟組織排泄，藥物代謝動力學研究表明，順鉑等化療藥物在96h內有25%～45%通過尿液排出體外[11]。大量臨床試驗證實，化療藥物在殺傷腫瘤細胞的同時，對機體正常的腎臟組織及細胞也具有不同程度的損害，主要表現為腎小管損傷，臨床上可表現為血尿素氮(BUN)及肌酐(Cr)升高，肌酐清除率降低，反復高劑量治療則可致持久性輕、中度腎損害[12]。化療藥物對腎臟的毒副作用主要表現為氧化損傷，引發凋亡、炎癥反應等[13-15]。化療藥物可通過激活MAPK凋亡相關通路，促進凋亡相關蛋白caspase 3、caspase 9等的表達，誘導腎臟組織細胞的凋亡[16]。從中醫學辨證論治上來講，順鉑的毒副作用屬于藥毒致病的范疇，在致病機制上表現為臟腑的毒性損害以及功能異常，因此在治療和預防上應當以扶正解毒、調理臟腑功能等為主要治則治法。同時現代研究也證實益氣扶正的中藥對順鉑引起的腎臟毒性具有一定的減毒作用[17]。歸芪白術方由《普濟方》卷二七二之“黃芪膏”加味制備而成，由黃芪、當歸、白術、大黃、白芍、陳皮、炙甘草等7味中藥組成，該方攻補兼施、扶正與祛邪兼顧，諸藥共奏益氣補血、活血解毒、健脾疏肝等功效，臨床上常用于氣血不足、血瘀毒結等病癥，因此，從中醫學上來講歸芪白術方能夠有效減輕順鉑對機體產生的毒副作用。

飲食情況和體重變化反映了小鼠的生存質量，本實驗觀察到小鼠注射順鉑后，體重和飲食量均明顯降低，提示順鉑引起了小鼠生存質量的降低；給予歸芪白術方后，小鼠的體重以及飲食量增加。順鉑最常見的副作用是腎臟損害[18]，故推測順鉑引起小鼠生存質量降低可能與其腎毒性有關。本實驗主要通過對順鉑腎臟毒性的研究，探索歸芪白術方減輕順鉑腎臟毒性，提高生存質量的機制。本研究結果顯示，順鉑可引起小鼠腎臟顏色明顯變淺，體積明顯變小，給予歸芪白術方后小鼠腎臟顏色加深，體積增大。血常規檢查發現，注射順鉑后WBC、PLT明顯降低，給予歸芪白術方后WBC、PLT有所升高。腎臟指數和腎臟功能分析顯示，注射順鉑后腎臟指數明顯降低，BUN、Scr含量明顯升高，給予歸芪白術方后腎臟指數有所升高，BUN、Scr含量有所降低。腎臟病理形態學觀察可見，注射順鉑后腎臟組織出現了明顯的病理損傷，歸芪白術方干預后腎臟病理損傷得到緩解，中劑量組緩解最為明顯。即往研究表明，順鉑的腎毒性主要表現在可引起腎臟組織細胞的凋亡等[19]，因此本研究檢測了各組小鼠腎臟組織中促凋亡相關蛋白caspase 3、caspase 9的表達情況，結果可見注射順鉑后腎臟組織中caspase 3、caspase 9的表達明顯上調，給予歸芪白術方后腎臟組織中caspase 3、caspase 9的表達降低，以歸芪白術方中劑量組最為明顯。該結果提示，歸芪白術方對順鉑引起的腎臟損傷的保護作用無明顯的量效關系，這可能與中藥復方中各個成分的劑量和配伍有關，并不能認為中藥復方劑量越大效果越好，這也間接證實了中藥復方合理劑量及配伍的重要性。本研究較系統地探索了歸芪白術方減輕順鉑腎臟損傷的作用機制，結果顯示可能與其改善血液活力、減少腎臟細胞的凋亡有關，這與中醫學認為歸芪白術方可通過益氣補血、活血解毒等作用減輕順鉑的腎臟毒副作用的觀點一致。

本研究通過檢測注射順鉑后各干預組小鼠體重、飲食變化的情況，評估了各組小鼠的生存質量，并推測順鉑導致小鼠生存質量降低的原因可能與順鉑的腎臟毒性相關。因此進一步檢測了注射順鉑后各干預組小鼠腎臟大體形態變化、血常規變化、腎臟指數及腎臟功能變化、腎臟組織病理學改變、腎臟組織中促凋亡蛋白caspase 3和caspase 9的表達情況，從而對歸芪白術方減輕順鉑所致小鼠腎臟損害的作用及其機制進行了系統的探索和研究。雖然本研究結果顯示歸芪白術方對順鉑所致腎臟損害具有防治作用，然而臨床上的療效如何，是否具有等效作用還有待進一步的臨床研究并根據臨癥時的加減變化等進行調整。