三葉糖脂清DPP-4抑制成分篩選及其調(diào)控JNK/AKT信號(hào)通路改善胰島素抵抗的機(jī)制研究

石蔚華趙筱萍陳曉玲

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

胰島素抵抗是外周組織和靶器官對(duì)胰島素的敏感性降低的一種代謝狀態(tài)，是2型糖尿病發(fā)病的主要病理機(jī)制之一。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是造成胰島素抵抗的關(guān)鍵因素。當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激以及炎癥因子增多時(shí)，會(huì)激活JNK蛋白等進(jìn)一步放大炎癥，促使胰島素信號(hào)通路受損，最終導(dǎo)致胰島素受體細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗[1-3]。

研究表明，2型糖尿病和代謝紊亂的肥胖患者體內(nèi)的二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase-4，DPP-4）分泌明顯增高[4]。抑制DPP-4活性可有效延長胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1,GLP-1）半衰期，刺激胰島β細(xì)胞增殖與胰島素分泌，降低糖化血紅蛋白，調(diào)節(jié)血脂，并能提高肝臟和肌肉等組織對(duì)胰島素的敏感性，改善胰島素抵抗[5]，因此DPP-4已成為治療2型糖尿病的重要靶點(diǎn)之一。目前已應(yīng)用于臨床的DPP-4抑制劑，如西他列汀、維格列汀等，不但價(jià)格昂貴而且存在頭痛、鼻咽炎、過敏等不良反應(yīng)。上述因素一定程度上限制了這些DPP-4抑制劑的臨床應(yīng)用。而中藥資源豐富，相對(duì)副作用較小，在改善糖尿病及諸多并發(fā)癥方面具有優(yōu)勢(shì)，近年來以DPP-4為靶點(diǎn)的中藥降糖機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)[6-8]。

三葉糖脂清是我國著名中醫(yī)藥專家張伯禮院士研制的新藥，由桑葉、荷葉、山楂葉、丹參、赤芍5味中藥組成，具有升清降濁、化瘀消痞的功效。研究表明三葉糖脂清可以降低血糖、調(diào)節(jié)血脂、改善糖脂代謝紊亂[9-11]。本研究擬探究三葉糖脂清中是否具有DPP-4抑制成分并構(gòu)建胰島素抵抗細(xì)胞模型，進(jìn)一步探討其改善糖脂代謝的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑與藥物 小分子熒光探針?biāo)谋揭蚁?賴氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-谷氨酸（TPE-KFPE）由上海淘普生物科技有限公司合成；錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，Mn-SOD） 檢測試劑盒、內(nèi)參GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠IgG抗體、細(xì)胞裂解液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：S0103、AF0006、A0208/A0216、P0013）；BCA Protein Assay Kit 購自美國Thermo公司（批號(hào)：TC263599）；低糖 DMEM 培養(yǎng)液購于美國Corning公司（批號(hào)：10018009）；低糖無酚紅培養(yǎng)液購于美國Gibco公司（批號(hào)：1782845）；葡萄糖檢測試劑盒購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司（批號(hào)：20171205147）；超氧化物歧化酶 2（superoxide dismutase 2，SOD2）抗體、磷酸化蛋白激酶 B（phospho-protein kinase B，p-AKT/PKB）抗體、蛋白激酶 B（protein kinase B，AKT/PKB）抗體、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（phospho-c-Jun N-terminal kinase，p-JNK）抗體、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）抗體購自美國Cell Signaling Technology公司（批號(hào)：13141、4060、4691、4668、9225）；Western blot抗體剝離緩沖液購自美國Thermo公司（批號(hào)：SL258473）；小鼠白細(xì)胞介素-6（interleukin-6,IL-6）ELISA檢測試劑盒購自美國Ebioscience公司（批號(hào)：887064）；小鼠白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）ELISA 檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司（批號(hào)：A201B80633）；DPP-4購自以色列ProSpec公司（批號(hào)：ENZ-375）；胰島素購自美國Sigma公司（批號(hào)：I113907）；西他列汀購自大連美侖生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：MB1788）；隱丹參酮、丹酚酸B二甲酯購自上海源葉生物科技有限公司（批號(hào)：C28M6Y1、M29J651999）；三葉糖脂清總提取物粉末由天津中醫(yī)藥大學(xué)提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 小鼠胚胎肝細(xì)胞BNL.CL2購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 方法

1.2.1 三葉糖脂清中DPP-4抑制成分的篩選及量效考察 本研究采用課題組前期建立的DPP-4抑制成分篩選方法[12]，篩選得到DPP-4抑制率大于50%的化合物。評(píng)價(jià)各個(gè)化合物在不同濃度（10、20、30、40、50μmol·L-1）對(duì) DPP-4的抑制作用，考察量效關(guān)系。

1.2.2 三葉糖脂清總提取物及DPP-4抑制成分對(duì)BNL.CL2細(xì)胞存活率的影響 對(duì)數(shù)生長期的BNL.CL2細(xì)胞以5×103/孔的數(shù)量接種于96孔板，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁生長。24h后吸去培養(yǎng)液，每孔分別加入100μL含三葉糖脂清提取物（200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625μg·mL-1）或其 6 個(gè) DPP-4 抑制成分（50、25、12.5μmol·L-1）的培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)另設(shè)空白對(duì)照組。24h后將原96孔板中的培養(yǎng)液吸盡，避光，每孔加入濃度為0.5mg·mL-1的MTT液100μL，培養(yǎng)箱孵育4h后吸去上清液，每孔加入 DMSO溶液 100μL，37℃振搖 10min，酶標(biāo)儀580nm處測定各孔吸光度。

1.2.3 胰島素抵抗BNL.CL2細(xì)胞模型的建立、分組和給藥 對(duì)數(shù)生長期BNL.CL2細(xì)胞以2×104/孔的數(shù)量接種于96孔板，以含血清的低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。24h后將培養(yǎng)液換為不含血清的低糖無酚紅培養(yǎng)液，將細(xì)胞分為5組，空白組（僅含有培養(yǎng)基）、對(duì)照組（在培養(yǎng)細(xì)胞中增加終濃度為0.1%的DMSO）、模型組（在培養(yǎng)細(xì)胞中增加終濃度為1μmol·L-1的胰島素）、陽性藥組（在培養(yǎng)細(xì)胞中增加終濃度為300μmol·L-1的西他列汀和1μmol·L-1的胰島素）和給藥組（在培養(yǎng)細(xì)胞中增加終濃度為50μg·mL-1三葉糖脂清總提取物或 50μmol·L-1DPP-4 抑制成分和終濃度為 1μmol·L-1的胰島素）。培養(yǎng)36h后，收集各組細(xì)胞上清液10μL于新的96孔板中，采用葡萄糖氧化酶法檢測培養(yǎng)上清液中葡萄糖含量，然后吸去原96孔板中的培養(yǎng)液，避光，每孔加入濃度為0.5mg·mL-1的MTT液100μL，培養(yǎng)箱孵育4h后吸去上清液，每孔加入DMSO溶液100μL，37℃振搖10min后，酶標(biāo)儀580nm處測定各孔吸光度。各組細(xì)胞的單位葡萄糖消耗量=（空白組葡萄糖含量-其他各組葡萄糖含量）/各組細(xì)胞MTT吸光度值。

1.2.4 胰島素抵抗BNL.CL2細(xì)胞炎癥因子IL-1β和IL-6的含量測定 對(duì)數(shù)生長期的BNL.CL2細(xì)胞以5×105/孔的數(shù)量接種于6孔板，以含血清低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。24h后換為不含血清的低糖無酚紅培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置和給藥濃度同1.2.3。培養(yǎng)36h后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，ELISA法檢測IL-1β和IL-6含量。

1.2.5 胰島素抵抗BNL.CL2細(xì)胞Mn-SOD的測定 對(duì)數(shù)生長期BNL.CL2細(xì)胞以5×105/孔的數(shù)量接種于6孔板，以含血清低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。24h后換為不含血清的低糖無酚紅培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置和給藥濃度同1.2.3。培養(yǎng)36h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入2mL含0.1μmol·L-1胰島素的低糖無酚紅培養(yǎng)液，孵育30min。用WST-8法檢測Mn-SOD含量，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。用BCA法測定各孔蛋白濃度。各組單位Mn-SOD含量=每孔Mn-SOD含量/每孔蛋白濃度。

1.2.6 Western blot檢測胰島素抵抗BNL.CL2細(xì)胞p-JNK、JNK、AKT、p-AKT、SOD2 蛋白表達(dá) 對(duì)數(shù)生長期BNL.CL2細(xì)胞以5×105/孔的數(shù)量接種于6孔板，用含血清低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。24h后更換為不含血清的低糖無酚紅培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置和給藥濃度同1.2.3。培養(yǎng)36h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入2mL含0.1μmol·L-1胰島素的低糖無酚紅培養(yǎng)液，孵育30min。收集細(xì)胞，提取總蛋白，以BCA法進(jìn)行蛋白定量。采用SDS-PAGE凝膠電泳分離約1h后，用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉室溫封閉1h。結(jié)束后分別加入一抗，p-JNK（1:1 000）、p-AKT（1:1 000）、SOD2（1:1 000）、GAPDH（1:1 000），4℃孵育過夜。TBST 洗膜 3次，再分別加入二抗，抗兔IgG抗體（p-JNK、p-AKT、SOD2）或抗鼠IgG 抗體（GAPDH），室溫孵育1h。TBST洗膜3次，加入發(fā)光顯影液，用BIO-RAD化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀進(jìn)行曝光和圖片采集。曝光結(jié)束后，用Stripping Buffer孵育蛋白條帶10min洗去一抗p-JNK、p-Akt，TBST 洗膜后，封閉 0.5h，重新孵育一抗JNK（1:1 000）、AKT（1:1 000），處理過程同上操作。采用Image Lab軟件分析各條帶的灰度值，以相對(duì)灰度值（磷酸化蛋白條帶灰度值/對(duì)應(yīng)總蛋白條帶灰度值）表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 三葉糖脂清中DPP-4抑制成分的篩選及量效考察結(jié)果 篩選發(fā)現(xiàn)三葉糖脂清中6個(gè)化合物對(duì)DPP-4的抑制率大于50%，分別為紫云英苷（99.57±1.13）%、丹酚酸 C（94.27±1.31）%、9'''-丹酚酸 B 單甲酯（91.83±5.76）%、丹酚酸 B 二甲酯（86.46±6.17）%、隱丹參酮（83.17±5.16）%、丹參酮ⅡA（54.71±5.01）%。6個(gè)化合物對(duì)DPP-4抑制率隨著濃度的增高而增高。相比同組低濃度（10μmol·L-1），高濃度（50μmol·L-1）抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明 6個(gè)化合物在 10～50μmol·L-1范圍內(nèi)對(duì) DPP-4的抑制作用具有良好的量效關(guān)系。見圖1。

2.2 三葉糖脂清總提取物及DPP-4抑制成分對(duì)細(xì)胞存活率的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，三葉糖脂清總提取物濃度≤50μg·mL-1時(shí)，BNL.CL2細(xì)胞存活率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；當(dāng)濃度≥100μg·mL-1時(shí)，BNL.CL2 細(xì)胞存活率下降，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。紫云英苷、丹酚酸C、9'''-丹酚酸B單甲酯、丹酚酸B二甲酯、隱丹參酮、丹參酮ⅡA處理濃度≤50μmol·L-1時(shí)，均對(duì)BNL.CL2細(xì)胞存活率無顯著影響，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表 1-2。

2.3 三葉糖脂清總提取物及DPP-4抑制成分對(duì)細(xì)胞葡萄糖消耗的影響 與對(duì)照組比較，含1μmol·L-1胰島素的無酚紅培養(yǎng)基刺激BNL.CL2細(xì)胞36h后，細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗量顯著降低（P＜0.01），說明胰島素抵抗的BNL.CL2細(xì)胞模型建立成功。與模型組比較，陽性藥組和隱丹參酮細(xì)胞葡萄糖消耗增加（P＜0.05），三葉糖脂清總提取物組細(xì)胞葡萄糖消耗增加更明顯（P＜0.01）。見圖 2。

2.4 三葉糖脂清總提取物及DPP-4抑制成分對(duì)細(xì)胞炎癥因子IL-1β和IL-6表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組IL-1β和IL-6表達(dá)水平顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，三葉糖脂清總提取物組、陽性藥組和隱丹參酮組IL-1β和IL-6表達(dá)水平均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3。

圖1 三葉糖脂清提取物中6個(gè)化合物對(duì)DPP-4活性的抑制作用Fig.1 Dose-dependent inhibition of 6 compounds of SYTZQ on DPP-4

表1 三葉糖脂清總提取物對(duì)細(xì)胞存活率的影響（±s，%）Tab.1 Effect of SYTZQ total extract on cell viability(±s,%)

表1 三葉糖脂清總提取物對(duì)細(xì)胞存活率的影響（±s，%）Tab.1 Effect of SYTZQ total extract on cell viability(±s,%)

注：與空白對(duì)照組（0μmol·L-1）比較，##P＜0.01Note:Compared with blank control group(0μmol·L-1),##P＜0.01

濃度（μg·mL-1）細(xì)胞存活率100 98.78±1.87 98.60±0.95 99.14±2.01 99.09±2.39 96.85±4.91 95.41±1.94 85.25±1.74##82.52±1.18##0 1.5625 3.125 6.25 12.5 25 50 100 200

表2 三葉糖脂清中DPP-4抑制成分對(duì)BNL.CL2細(xì)胞存活率的影響（±s，%）Tab.2 Effect of DPP-4 inhibitors from SYTZQ on cell viability(±s,%)

表2 三葉糖脂清中DPP-4抑制成分對(duì)BNL.CL2細(xì)胞存活率的影響（±s，%）Tab.2 Effect of DPP-4 inhibitors from SYTZQ on cell viability(±s,%)

濃度（μ mol·L-1）0 50 25 12.5細(xì)胞存活率紫云英苷組 丹酚酸C組 9'''-丹酚酸B單甲酯組 丹酚酸B二甲酯組 隱丹參酮組 丹參酮ⅡA組100 100.29±9.50 98.06±10.30 95.97±13.23 100 99.9±12.25 99.36±2.59 99.34±4.91 100 102.25±8.47 97.72±8.96 96.27±7.10 100 98.99±5.78 99.6±7.62 96.93±6.59 100 97.5±12.8 93.6±2.86 92.88±3.95 100 93.59±+4.25 91.54±4.32 92.21±0.50

圖2 各組細(xì)胞葡萄糖消耗比較Fig.2 Comparison of glucose consumption in each group

圖3 各組細(xì)胞IL-1β和IL-6表達(dá)水平比較Fig.3 Comparison of expression of IL-1β and IL-6 in each group

2.5 三葉糖脂清及DPP-4抑制成分對(duì)細(xì)胞Mn-SOD表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞Mn-SOD表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01）。與模型組比較，陽性藥組和隱丹參酮組細(xì)胞的Mn-SOD表達(dá)水平增高（P＜0.05），三葉糖脂清總提取物組Mn-SOD表達(dá)水平增高更明顯（P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組細(xì)胞Mn-SOD表達(dá)比較Fig.4 Comparison of expression of Mn-SOD in each group

2.6 三葉糖脂清總提取物和隱丹參酮對(duì)細(xì)胞SOD2、p-JNK、JNK、p-AKT、AKT蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組p-AKT和SOD2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著減少（P＜0.01），p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增加（P＜0.05）。三葉糖脂清總提取物和隱丹參酮處理后，p-AKT蛋白表達(dá)呈增加趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），SOD2 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于模型組（P＜0.05），而p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量低于模型組（P＜0.01）。見圖5。

圖5 各組細(xì)胞SOD2、p-JNK、JNK、p-AKT、AKT蛋白表達(dá)比較Fig.5 Comparison of protein expression of SOD2,p-JNK,JNK,p-AKT,AKT in each group

3 討論

中藥具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多途徑的作用特點(diǎn)，因此在慢性復(fù)雜性疾病治療中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。本研究采用課題組建立的基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光現(xiàn)象的新型小分子熒光探針的體外篩選方法，從三葉糖脂清中篩選得到6個(gè)對(duì)DPP-4的抑制率大于50%的化合物，并證實(shí)在10～50μmol·L-1范圍內(nèi)以上化合物對(duì)DPP-4的抑制作用具有良好的量效關(guān)系。其中紫云英苷來自桑葉，其他5個(gè)均來自丹參。

三葉糖脂清總提取物及隱丹參酮均能促進(jìn)胰島素抵抗的BNL.CL2細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗，增加Mn-SOD的蛋白表達(dá)，減少炎癥因子IL-1β和IL-6的分泌。與西他列汀比較，三葉糖脂清總提取物能更顯著地增加胰島素抵抗BNL.CL2細(xì)胞的葡萄糖消耗。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三葉糖脂清總提取物、隱丹參酮均能上調(diào)胰島素抵抗BNL.CL2細(xì)胞SOD2蛋白表達(dá)，降低JNK蛋白磷酸化水平，提高AKT磷酸化水平。研究表明，氧化應(yīng)激以及炎癥因子如IL-6、TNF-α分泌增多時(shí)，會(huì)激活JNK信號(hào)通路，促進(jìn)胰島素受體底物絲氨酸磷酸化失活，進(jìn)而抑制其下游的磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）/AKT信號(hào)通路的激活，最終導(dǎo)致胰島素抵抗[13-14]。因此，三葉糖脂清總提取物及隱丹參酮可能通過降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平及抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)控JNK/PI3K/AKT信號(hào)通路來改善細(xì)胞胰島素抵抗。另外，文獻(xiàn)報(bào)道隱丹參酮具有降低氧化應(yīng)激和抗炎作用，且在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均具有抗糖尿病作用[15-16]。此外，趙玲玲等[17]曾報(bào)道隱丹參酮對(duì)AKT2敲除大鼠的高血糖現(xiàn)象無改善作用，上述研究與本文結(jié)果基本一致，進(jìn)一步表明激活A(yù)KT信號(hào)通路在隱丹參酮抗糖尿病作用機(jī)制中具有重要地位。

本實(shí)驗(yàn)中篩選得到的其他5個(gè)DPP-4抑制成分均未在胰島素抵抗BNL.CL2中發(fā)揮改善糖代謝的作用，可能與其靶細(xì)胞類型不同相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道丹酚酸B和丹參酮ⅡA在糖尿病大鼠腎細(xì)胞、心肌細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞等中發(fā)揮保護(hù)作用[18-21]。丹酚酸C和紫云英苷尚未見到糖尿病相關(guān)的細(xì)胞水平研究。

綜上所述，三葉糖脂清中含有DPP-4抑制作用的成分。三葉糖脂清總提取物及隱丹參酮可能通過降低氧化應(yīng)激和抗炎作用，抑制JNK蛋白活性，激活PI3K/AKT信號(hào)通路改善胰島素抵抗。三葉糖脂清總提取物及隱丹參酮可以通過多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮抗糖尿病作用，本研究為該復(fù)方的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。