體外培養(yǎng)乳牙牙髓干細胞向血管內(nèi)皮細胞定向分化的實驗研究*

劉瓊，文軍 ，吳小明，錢虹

[南方醫(yī)科大學口腔醫(yī)院（廣東省口腔醫(yī)院）1.兒童口腔科，2.牙體牙髓科，廣東 廣州 510280]

近年來提出的干細胞治療是指利用干細胞來替代、修復，并且加強受損組織與器官的生物學功能，最終達到臨床組織再生或修復的目的[1]。干細胞是一群具有自我更新和多向分化潛能的細胞，在組織器官生長、發(fā)育及損傷修復過程中發(fā)揮重要作用。許多組織器官的更新是通過干細胞來維持的。迄今為止，在諸多組織器官中都發(fā)現(xiàn)了成體干細胞，如骨骼肌、脂肪、神經(jīng)、軟骨滑膜團等[2]。在干細胞治療中，種子細胞是組織工程研究中的核心問題之一。

迄今分離到的6種牙源性干細胞包括：乳牙牙髓干細胞、成人牙髓干細胞、根尖乳頭干細胞、牙周膜干細胞、根尖乳頭干細胞及牙囊細胞[3]。本研究中用于研究的乳牙牙髓干細胞起源于神經(jīng)嵴外胚層，當其移動遷徙到頜面部后形成了外胚間充質(zhì)[4]。乳牙牙髓干細胞的首次分離是MIURA等[5]在2003年完成的，其具有自我更新和高度增殖的特性，并且具有間充質(zhì)干細胞的典型生物學特征。諸多文獻報道骨髓間充質(zhì)干細胞和內(nèi)皮細胞具有一定的相關(guān)性，且具有向內(nèi)皮細胞分化的潛能[6]。既往研究表明，乳牙牙髓干細胞可以在體外完成向神經(jīng)細胞、成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞及血管內(nèi)皮細胞的分化[7]，誘導物決定其分化方向。在不同誘導物提供的具有不同細胞外基質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、生長因子，以及信號分子的微環(huán)境中，牙髓干細胞可根據(jù)不同條件分化為不同類型的組織細胞[8]。本研究選取的乳牙牙髓干細胞具有以下優(yōu)點：①乳牙牙髓干細胞的增殖活性高于成人牙髓干細胞及其他牙源性干細胞[9]；②取材容易，可實現(xiàn)無創(chuàng)取材；③降低醫(yī)療成本；④可在短期內(nèi)獲得組織工程需要的細胞量[10]；⑤患兒及家長易接受，所受倫理爭議較少；⑥具有較低的凋亡性和衰老性，有研究表明其第10代細胞仍可保持細胞形態(tài)[11]；⑦可用于自體移植，理論上可有效避免免疫排斥反應[12]；⑧用于自體移植時，可降低交叉感染的風險[13]。

理論上牙髓干細胞可以分化為血管內(nèi)皮細胞[14]。牙髓中的血管系統(tǒng)可以通過提供營養(yǎng)物質(zhì)及運輸代謝廢物質(zhì)來維持牙髓代謝的平衡，目前血管移植技術(shù)已廣泛應用于臨床，在腫瘤、創(chuàng)傷、心血管疾病、顯微外科手術(shù)及器官移植中都有著重要地位[15]。在血管性疾病的組織工程學研究中，自體血管移植雖然具有組織相容性好、無免疫排異反應等優(yōu)勢，是最為理想的血管移植物，但是自體血管移植具有一定的局限性[16]。血管內(nèi)皮細胞是一類具有諸多生理功能的細胞，包括維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、維持正常免疫功能等；此外，其在心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展等方面也具有重要作用[17]。若血管內(nèi)皮細胞發(fā)生功能障礙，則可能引起血管痙攣、血管增生、血管異常收縮及血栓形成等典型的病理生理變化[18]。血管內(nèi)皮細胞可以移植用于修復血管內(nèi)膜及重建血管網(wǎng)[19]，血管內(nèi)皮細胞是血管組織工程化的核心，但由于其來源有限且增殖能力不強，在臨床應用中仍存在一定阻礙。故具有上述優(yōu)點的乳牙牙髓干細胞如果能在體外誘導分化為血管內(nèi)皮細胞，對其在細胞及組織工程學中的應用具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年7月—2017年9月南方醫(yī)科大學口腔醫(yī)院牙科29例健康兒童的滯留乳牙。充分消毒牙體周圍組織后拔牙，置于預冷的含有高倍雙抗的α-DMEM培養(yǎng)基轉(zhuǎn)運到實驗室，在4 h內(nèi)進行原代提取。納入標準：①所有研究對象及其家屬對本研究知情同意，并簽署知情同意書；②所有研究對象年齡在6～10歲。排除標準：①牙根吸收＞1/2乳前牙標本；②存在牙體牙髓疾病的標本；③存在遺傳性疾病的研究對象；④存在嚴重呼吸、循環(huán)、消化及其他系統(tǒng)疾病的研究對象。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器

倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），細胞培養(yǎng)孵箱（美國Thermo Scientific公司），Multiskan Mk3酶標儀（美國Thermo公司），水浴箱（上海中新儀器設(shè)備公司），SWCJ-1FD型凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠），EPICS-XL型流式細胞儀（美國Beckman Corlter公司），胎牛血清（fatal bovine serun, FBS）（美國Gibco公司），達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle's medium，DMEM）（美國Sigma公司），胰蛋白酶（美國Gibco公司），雙抗（美國Hyclone公司），基質(zhì)蛋白酶1單克隆抗體（stromal cell antigen-1,Stro-1）（美國Santa Cruz公司），Vimentin單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），包被抗小鼠IgM Micro Beads的免疫磁珠試劑盒（德國Miltenyi Biotec公司），人血管來源內(nèi)皮細胞（南京凱基生物有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 原代細胞提取 參考文獻的經(jīng)典方法[20]，將標本置入超凈臺中用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）反復沖洗，采用拔髓針拔取出牙髓組織。完全培養(yǎng)液浸潤下剪碎，將終濃度為3 g/L的Collagenase Type I（美國Gibco公司）和4 g/L的Dispase（美國Gibco公司）混合，在37℃水浴中消化1 h牙髓組織，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入培養(yǎng)液混勻沉淀，輕柔吹打，用70μm的濾網(wǎng)過濾后獲得細胞懸液，加入含20% FBS的α-DMEM培養(yǎng)液接種，置于37℃、5%二氧化碳CO2敷箱中培養(yǎng)。當達到生長融合時以1∶2的比例進行細胞傳代。

1.3.2 乳牙牙髓干細胞的分選 選取生長狀態(tài)良好的第3代乳牙牙髓細胞，胰酶消化制成細胞懸液后過30μm細胞篩，以含1% FBS的FBS重懸，調(diào)整細胞密度為1×106個/ml。向細胞懸液中加入FcR封閉液，置于4℃中孵育20 min。再加入Stro-1單克隆抗體），置于4℃中孵育1 h。用含0.1% FBS的PBS清洗3次后過30μm細胞篩。加入包被抗小鼠IgM MicroBeads的免疫磁珠，其是一種用于牙髓干細胞磁性標記的與Stro-1單克隆抗體相特異性偶聯(lián)的超順磁化微粒，嚴格按照試劑盒說明書進行分選操作，收集從分選柱流出的乳牙牙髓細胞置于37℃、5%CO2敷箱中培養(yǎng)以供后續(xù)實驗使用。

1.3.3 乳牙牙髓干細胞的鑒定 采用免疫組織化學染色法對分選出的乳牙牙髓干細胞進行鑒定。將分選后的乳牙牙髓干細胞用PBS清洗3遍，取95%乙醇固定20 min，用0.3%過氧化氫H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶10 min。用10% FBS封閉20 min，選取Vimentin單克隆抗體及Stro-1單克隆抗體作為其表面標記物，根據(jù)不同實驗將一抗室溫孵育2 h，之后嚴格按照試劑盒說明書進行染色。

1.3.4 乳牙牙髓干細胞向血管內(nèi)皮細胞的定向分化 血管內(nèi)皮細胞向誘導：選取分選后生長狀態(tài)良好的乳牙牙髓細胞，調(diào)整密度為1×105個/孔，采用常規(guī)培養(yǎng)液將其接種到6孔板上，待乳牙牙髓細胞完全貼壁融合后，將培養(yǎng)液更換為血管內(nèi)皮細胞向誘導培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)液1次/2 d。

1.3.5 血管內(nèi)皮細胞定向誘導培養(yǎng)基成分[21]α-DMEM培養(yǎng)基：2% FBS，50 μg/L的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），10 μg/L的bFGF，0.1 mg/L的地塞米松，2 g/L的牛血清白蛋白，1%的抗生素。

1.3.6 乳牙牙髓干細胞及血管內(nèi)皮細胞定向誘導后的細胞的鏡下形態(tài)觀察 分別取第3代的乳牙牙髓干細胞及血管內(nèi)皮細胞定向誘導14 d后的細胞置于倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)并拍照留存。

1.3.7 乳牙牙髓干細胞及血管內(nèi)皮細胞定向誘導后的細胞血管生成實驗 分別取第3代的乳牙牙髓干細胞及血管內(nèi)皮細胞向誘導14 d后的細胞，在4℃冰上融化Matrigel膠（美國Sigma公司），50 μl Matrigel膠包被96孔板，注意不要有氣泡，37℃、含5% CO2飽和濕度的敷箱中孵育培養(yǎng)30 min，加入1×105個/孔的細胞懸液，在倒置顯微鏡下觀察其體外血管生成過程。

1.3.8 乳牙牙髓干細胞及血管內(nèi)皮細胞定向誘導后的細胞免疫表型鑒定 采用免疫組織化學染色法來鑒定細胞的免疫表型，具體步驟如下：①分別取第3代的乳牙牙髓干細胞及血管內(nèi)皮細胞向誘導2周后的細胞接種于預先已經(jīng)置入玻片的12孔板上，待細胞貼壁融合1 h后，向12孔板內(nèi)加入常規(guī)培養(yǎng)液；②24 h后取出玻片，PBS沖洗后采用甲醇固定20 min，再用PBS充分清洗；③加入兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體，37℃、5% CO2敷箱中培養(yǎng)1 h，PBS沖洗3次；④加入辣根過氧化物酶標識的羊抗兔二抗，37℃、5%CO2敷箱中培養(yǎng)30 min，PBS沖洗3次；⑤DAB顯色5 min，蒸餾水沖洗10 min，蘇木精襯染2 min；⑥采用鹽酸復染，吹干，并用中性樹膠封片；⑦在顯微鏡下進行對比觀察并拍照存檔。

另取一組人血管來源內(nèi)皮細胞，采用相同的方法制作切片作為參照組。計數(shù)免疫組織化學染色陽性細胞所占百分率。每組細胞隨機觀察切片5個不同視野，取5個視野的平均值，根據(jù)細胞著色判斷。①陰性：不著色；②弱陽性：淺黃色；③中等陽性：中黃色或棕色且無背景著色，或深棕色，但背景色為淺棕色；④強陽性：深棕色或棕褐色，且無背景著色。陽性表達率（%）=陽性（弱陽性+陽性+強陽性）表達例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 人乳牙牙髓干細胞的鑒定結(jié)果

人乳牙牙髓干細胞免疫組織化學染色可見波形蛋白染色和Stro-1染色呈強陽性。見圖1、2。

2.2 鏡下形態(tài)觀察結(jié)果

鏡下未經(jīng)誘導的乳牙牙髓干細胞呈長梭形，少數(shù)為多角形橢圓形，胞體豐滿，體積較小（見圖3A）。經(jīng)過血管內(nèi)皮定向誘導14 d后的乳牙牙髓干細胞呈多角形或梭形相互嵌合排列，呈典型的鵝卵石或鋪路石樣，細胞間相互連接緊密（見圖3B）。

圖1 人乳牙牙髓干細胞表達 （波形蛋白染色×10）

圖2 人乳牙牙髓干細胞表達 （Stro-1染色×40）

2.3 血管生成實驗結(jié)果

經(jīng)過血管內(nèi)皮定向誘導14 d后的乳牙牙髓干細胞接種于基質(zhì)膠后，6 h后在鏡下可呈現(xiàn)明顯的血管樣結(jié)構(gòu)（見圖4A）。而未經(jīng)誘導的乳牙牙髓干細胞在血管生成實驗中，接種于基質(zhì)膠后6 h細胞集聚成團狀，不能形成血管樣結(jié)構(gòu)（見圖4B）。

2.4 免疫表型鑒定結(jié)果

乳牙牙髓干細胞血管內(nèi)皮細胞定向誘導后的細胞染色陽性率為（80.377±4.489）%，與作為參照組的人血管來源內(nèi)皮細胞的細胞染色陽性率（82.191±5.012）%比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.645，P=0.479）。

免疫組織化學染色結(jié)果顯示，乳牙牙髓干細胞血管內(nèi)皮細胞定向誘導14 d后其細胞表型發(fā)生變化，倒置顯微鏡下可見胞漿內(nèi)存在棕褐色沉淀，其中核周最為明顯（見圖5A）；未經(jīng)誘導的乳牙牙髓干細胞細胞因子相關(guān)抗原染色呈陰性（見圖5B）。

圖4 血管生成實驗結(jié)果 （×10）

圖5 免疫表型鑒定結(jié)果 （×10）

3 討論

乳牙牙髓組織中含有牙本質(zhì)細胞、未分化間充質(zhì)細胞，以及成纖維細胞等多種細胞成分，因此想要分離得到純化的乳牙牙髓干細胞進行后續(xù)實驗，就需要從這些混合細胞中分離出所需要的細胞。目前針對干細胞的分離方法主要包括流式細胞儀分選法、單細胞克隆法、密度梯度離心法、貼壁篩選法、免疫磁珠分選法等[22]。免疫磁珠分選法是指將偶聯(lián)在抗體上的磁珠標記在細胞上，利用抗體對細胞表面抗原的特異性識別，在磁場的作用下分選需要的細胞，其具有細胞處理量大、分離純度高、分選后細胞活力好等優(yōu)點[23]。本研究采用此法成功分離出純化的乳牙牙髓干細胞。

在國外研究中，KARBANOVá等[24]選擇20 μg/L質(zhì)量濃度的VEGF誘導牙髓干細胞，7 d后檢測到血管內(nèi)皮細胞標志物vWF的表達。ISHKITIEV等[25]發(fā)現(xiàn)，乳牙牙髓干細胞形成的微血管可以與宿主的脈管系統(tǒng)相吻合。SAKAI等[26]發(fā)現(xiàn)，乳牙牙髓干細胞在VEGF的作用下可表達血管內(nèi)皮細胞特有的表面標志物。

但在這一領(lǐng)域國內(nèi)相關(guān)研究數(shù)量甚少，針對乳牙牙髓干細胞的分化多為成骨以及成脂向的研究。血管內(nèi)皮細胞呈扁平多角形，邊界清楚，典型形態(tài)為倒置顯微鏡下呈鵝卵石或鋪路石樣。本研究中的誘導培養(yǎng)基條件為：α-DMEM培養(yǎng)基，2% FBS，0.1μmol/L地塞米松，50μg/L VEGF，10μg/L bFGF，2 g/L牛血清白蛋白，1%抗生素，在此條件下對乳牙牙髓干細胞進行血管向誘導并分別對乳牙牙髓干細胞及血管內(nèi)皮細胞定向誘導后的細胞的鏡下形態(tài)觀察，進行血管生成實驗以及免疫表型鑒定。結(jié)果表明鏡下未經(jīng)誘導的乳牙牙髓干細胞鏡下呈長梭形，少數(shù)為多角形橢圓形，胞體豐滿，體積較小，與既往研究中報道的相一致[27]。經(jīng)過血管內(nèi)皮定向誘導14 d后的乳牙牙髓干細胞，呈多角形或梭形相互嵌合排列，呈典型的鵝卵石或鋪路石樣，細胞間相互連接緊密，說明其已經(jīng)具有血管內(nèi)皮細胞的形態(tài)特征。在血管生成實驗中，未經(jīng)誘導的乳牙牙髓干細胞不能形成血管樣結(jié)構(gòu)，而經(jīng)過血管內(nèi)皮定向誘導14 d后的乳牙牙髓干細胞可呈現(xiàn)明顯的血管樣結(jié)構(gòu)，表明經(jīng)過誘導后的細胞具有了血管內(nèi)皮細胞的血管生成這項生物學功能。在免疫表型鑒定的研究中，未經(jīng)誘導的乳牙牙髓干細胞細胞因子相關(guān)抗原染色呈陰性，而乳牙牙髓干細胞血管內(nèi)皮細胞定向誘導后的細胞的細胞染色陽性率為（80.377±4.489）%，說明經(jīng)過誘導后的細胞具有了血管內(nèi)皮細胞的免疫表型。以上結(jié)果證實在本研究中的誘導條件下，成功將乳牙牙髓干細胞誘導為血管內(nèi)皮細胞，證明乳牙牙髓干細胞具有血管生成的分化能力。

雖然在國內(nèi)外已經(jīng)有很多研究關(guān)于牙髓干細胞的血管生成研究，但在國內(nèi)針對牙髓干細胞多為成骨研究，針對血管生成領(lǐng)域仍屬于摸索研究階段。在本研究的基礎(chǔ)上，本課題組可進行血管生成后續(xù)相關(guān)的研究，如分化后的細胞人乳牙牙髓干細胞在牙科材料學上的應用等，牙髓干細胞的血管生成這一基礎(chǔ)性研究為明確牙髓干細胞的特性特點并使其進一步得到實際應用奠定了基礎(chǔ)。目前尚有以下幾點問題待進一步研究解決：一是誘導乳牙牙髓干細胞血管生成的最佳VEGF濃度尚待探索，是否存在優(yōu)于本研究方案的誘導培養(yǎng)基條件；二是誘導后的血管內(nèi)皮細胞在組織工程中實際應用是否可達到預期的效果。隨著對乳牙牙髓干細胞向血管內(nèi)皮細胞誘導分化的深入研究，并建立起乳牙牙髓干細胞分離培養(yǎng)的統(tǒng)一標準，乳牙牙髓干細胞有可能成為血管生成的理想種子細胞。