微波輻照對牙周膜細胞中白細胞介素6 的影響

陳曄 謝文泵 莊文捷

白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）是一種細胞因子，它的來源很廣泛，其生物學活性多樣，在機體的炎癥反應及免疫應答中發揮著至關重要的作用[1-2]。許多研究表明，白細胞介素-6的表達在病變的牙周組織中廣泛的存在，并且明顯高于在正常牙周組織中的表達[2-3]。IL-6的表達水平已經成為牙周組織破壞程度的指標，誘導牙周組織血管內皮生長因子表達，炎癥細胞增多及能量消耗，從而加重炎癥反應。牙周炎癥時患牙齦溝液（gingival crevicular fluid，GCF）中IL-6的水平比正常牙中高出許多，并且牙周組織的破壞和牙周疾病的嚴重程度與IL-6的水平成正比關系[3-4]。本研究的目的是比較在微波治療后人牙周膜細胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）IL-6的水平的變化，為臨床使用微波來治療牙周疾病提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 主要器材和試劑

青-鏈霉素混合液（Hyclone，美國），DMEM低糖培養基（GIBCO,美國），胎牛血清（GIBCO，美國） 胰蛋白酶（GIBCO，美國），MTS（Promega， 美國），二甲基亞砜（Sigma,美國），酶聯免疫檢測儀（Biotek POWERWAVE，美國），微波治療儀（新技術研究所，南京），人白細胞介素6 ELISA 試劑盒（欣博盛，深圳）。

1.2 標本取材及原代培養

收集2018年7月醫院口腔科門診12～17歲因正畸治療而拔除的健康前磨牙10顆（共5位患者，征求患者及家長同意），要求患者術前用3%H2O2漱口，然后口內及口周分別使用75%的酒精消毒，拔牙中注意避免損傷牙齒的牙周組織，拔牙后馬上把前磨牙放入含雙抗（青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL）的無菌磷酸鹽緩沖液（PBS液）中，在超凈臺內，牙根面的血污使用含雙抗的PBS液反復沖洗去除干凈，再將根中1/3牙周膜組織用手術刀片輕刮取，用眼科剪將牙周組織剪成1 mm3大小，放置于合成細胞培養基（DMEM）培養液中浸泡。使用6孔板，滴入含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素、200 mL/L的胎牛血清的DMEM培養液在每孔內，在6孔板中的培養液中放入剪好的牙周組織塊，每孔放入5～6塊。組織塊上慢慢蓋上滅菌的蓋玻片，然后輕輕加壓，使蓋玻片與組織塊之間充盈著培養液，不能有氣泡產生，加體積分數為10%的胎牛血清的DMEM 培養液3 mL，放入100%濕度，5% CO2的37℃細胞培養箱中培養，每3天更換培養液一次。第2天在鏡下觀察有無細菌污染組織塊，取細胞培養板時要求輕拿輕放，盡量避免晃動培養板，3天后每天在倒置顯微鏡下觀察細胞游出情況，生長狀況和形態特征。當看到組織塊周圍有細胞密集生長時，可以進行原孔消化。倒掉原培養液，用PBS緩沖液輕輕漂洗培養板兩遍，用無菌鑷子夾出蓋玻片，滴加2.5 g/L的胰蛋白酶，至鋪滿培養板底。鏡下觀察，當細胞質回縮變圓，細胞間隙變大時，停止滴加胰酶，再加體積分數為10%胎牛血清的DMEM培養液3 mL。輕輕吹打培養板，使孔板內細胞均勻分布，換培養箱繼續培養[5-6]。

1.3 細胞傳代培養

傳代培養需等到原孔消化，孔板底部表面積80%～90%有細胞生長。

1.4 微波照射分組及方法

當對數期生長到第4代hPDLCs單細胞懸液時，取出10 μL與等體積0.4%臺盼藍混勻，用細胞計數板來計數細胞活力。根據計數結果來制備2.0×104/mL的細胞懸液（含10%胎牛血清DMEM培養液）。為了減少組間差距。每種6個孔，細胞懸液重新混勻后再接種，并且按照“s”型接種。將hPDLCs單細胞懸液隨機分組，共分對照組共24孔（僅含胎牛血清FBS的DMEM培養基）：只加培養液而沒有細胞，不接受微波照射。高劑量組共24孔（10 μg/mL LPS＋微波輻照40 s）：細胞懸液加入含10 μg/mL的LPS的培養基進行誘導并接受40 s微波照射。中劑量組共24孔（10 μg/mL LPS＋微波輻照20 s）：細胞懸液加入含10 μg/mL的LPS的培養基進行誘導并接受20 s微波照射。低劑量組共24孔（10 μg/mL LPS＋微波輻照10 s）：細胞懸液加入含10 μg/mL的LPS的培養基誘導并接受10 s微波照射。模型組共24孔（10 μg/mL LPS）：細胞懸液加入含10 μg/mL的LPS的培養基進行誘導不接受微波照射。每孔接種100 μL。調整治療儀的輸出模式為治療模式，調節為14 W的輸出功率，輻照后進行細胞培養24 h、48 h后提取培養上清液。

1.5 ELISA法檢測IL-6的表達

把上述細胞組條件培養液在常溫下溶解。按ELISA試劑說明書，分別在包被了人IL-6單抗的ELISA 120孔板中加入100 μL細胞條件培養液，使用雙抗體夾心法檢測。待終止反應后，用酶聯免疫檢測儀Bio-tek檢測450 nm的光密度值（D450）。根據ELISA試劑盒中的IL-6標準品D450值曲線，換算出所測定細胞條件培養液中IL-6的水平。

1.6 統計學分析

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據處理，計量資料數據以表示，采用t 檢驗和單因素方差分析，兩組間差異的顯著性檢驗用 LSD 檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

低功率微波對人牙周膜細胞分泌IL-6的影響如表1所示：10 μg/mL LPS刺激hPDLCs的模型組24 h、48 h[（0.870±0.065）pg/mL，（0.891±0.024）pg/mL]后IL-6表達均高于對照組[（0.515±0.091）pg/mL，（0.560±0.126）pg/mL]、高劑量組[（0.582±0.090）pg/mL，（0.620±0.117）pg/mL]、中劑量組[（0.760±0.147）pg/mL，（0.730±0.161）pg/mL]，且差異有統計學意義（P＜0.05）；但與低劑量組[（0.835±0.132）pg/mL，（0.845±0.092）pg/mL]比較，輻照時間為10 s時，24 h、48 h后IL-6的表達量與相應模型組[（0.870±0.065）pg/mL，（0.891±0.024）pg/mL]比較差異無統計學意義（P＞0.05），而輻照時間為20 s、40 s時，IL-6表達量均較模型組低（P＜0.05），且隨著輻照時間延長，IL-6的表達明顯受到抑制，且呈劑量依賴性。

3 討論

微波熱療是將微波能量集中照射病變部位，被人體組織吸收后，產生微波熱效應[7]、生物效應等。通過血流速度和血循環量增加促進血液循環來促進炎癥吸收，改善對細胞的營養供給、局部代謝及營養狀態，提高組織再生能力，促進局部炎癥消退。微波產熱快，受熱均勻且局限。組織細胞膜通透性增加，局部組織營養、代謝加快，白細胞的吞噬功能增加，機體免疫力增加，促進新陳代謝[8]。另外，微波輻射是一種電磁輻射，微波的非熱療效應可通過電磁場影響組織的分子結構。生物體細胞內外液中含有大量的帶電離子，極性和無極性分子在微波電場作用下發生振動和偏轉，組織內溫度升高，毛細血管擴張，血液灌注量增加。組織細胞的營養供和細胞新陳代謝能力亦顯著提高。促進新肉芽的生長，同時對細胞功能和形態恢復的意義也很重大。大量具有免疫功能的相關分子聚集于炎癥組織，有效清除代謝產生的影響細胞正常活動的物質，調節局部的酸堿失衡。恢復細胞的微環境，達到消炎、消腫和除痛的療效。班燕欣等[8]用微波對DIO、OSSTEM、ITI3種類型種植體周圍炎進行治療，有效率達到95%左右，痊愈率達到90%。表明微波治療對不同種類的種植體周圍炎均有效。

病原微生物與局部刺激因素能引起牙周組織直接損傷，宿主持續存在的菌斑微生物的免疫應答所同時造成牙周組織的間接損傷[9]。LPS刺激巨噬細胞、成纖維細胞等之后，細胞合成并分泌IL-1、IL-6、IL-8，前列腺素及腫瘤壞死因子（tumor necrosisfactor，TNF）等多種炎性遞質，最終將破壞牙周結締組織和導致牙槽骨吸收[10]。其中IL-6為多功能的細胞因子，許多活性與牙周炎發病機制都有相關性[10-12]。IL-6等細胞因子具有調控牙周疾病發生發展作用，在宿主反應過程中也至關重要，不但直接導致牙周組織的破壞，而且不斷的影響宿主的炎癥和免疫反應[13]。黃輝等[14]研究分析二甲雙胍對實驗性糖尿病牙周炎大鼠炎癥因子IL-6表達的影響，結論認為二甲雙胍能降低實驗性糖尿病牙周炎大鼠IL-6的表達水平。

表1 低功率微波對人牙周膜細胞分泌IL-6 的影響（pg/mL，

注：對照組（僅含FBS 的DMEM 培養基）、高劑量組（10 μg/mL LPS ＋微波輻照40 s）、中劑量組（10 μg/mL LPS ＋微波輻照20s）、低劑量組（10 μg/mL LPS ＋微波輻照10s）、模型組（10 μg/mL LPS）

輻照時間 對照組 模型組 低劑量組（10 s） 中劑量組（20 s） 高劑量組（40 s）輻照24 h 后 0.515±0.091 0.870±0.065 0.835±0.132 0.760±0.147 0.582±0.090輻照48 h 后 0.560±0.126 0.891±0.024 0.845±0.092 0.730±0.161 0.620±0.117

研究表明[15-17]，微波治療可以降低慢性牙周炎患者齦溝液中堿性磷酸酶（alkaline phosphatase ALP）、天冬氨酸轉氨酶及彈性蛋白酶的水平，對牙周炎有確切的治療作用。本研究通過酶聯免疫吸附試驗觀察微波輻照對LPS作用下HPDLCs中IL-6蛋白表達的影響，發現模型組明顯高于對照組及高、中劑量組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。這提示，相對于在LPS作用下IL-6高表達的正常牙周膜成纖維細胞（human periodontal ligament fibroblast，HPDLF），微波輻照顯著降低LPS作用下HPDLCs的IL-6表達，并且隨輻照劑量的增加，抑制IL-6的作用增強，這可能與微波能抑制炎癥狀態的牙周膜細胞增殖有一定關系。而低功率微波是否對LPS作用下HPDLCs的凋亡產生影響，從而影響IL-6的分泌，這可能需要更多的進一步研究探討。

綜上，本實驗結果認為微波輻照能夠顯著降低LPS作用下人牙周膜成纖維細胞IL-6的表達，臨床上選擇14 W低功率微波照射脂多糖誘導的人牙周膜細胞，隨輻照劑量的增加，抑制IL-6的作用增強。