應用真空滲透法將SFL基因轉入水稻的研究

鐘巧芳，李定琴，李維蛟，陳 越，柯 學，陳 玲，肖素勤，王 波，楊 久，程在全*

(1.云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所/云南省農業生物技術重點實驗室/農業部西南作物基因資源與種質創制重點實驗室，云南 昆明 650223；2.西南醫科大學，四川 瀘州 646000；3.云南中醫學院，云南 昆明 650500；4.云南金瑞種業有限公司，云南 昆明 650214)

【研究意義】水稻(OryzasativaL.)是重要的糧食作物之一，是全球1/2以上人口的主食。稻瘟病是水稻上危害最嚴重的真菌病害，嚴重威脅著水稻的高產、穩產[1]。尤其云南省等西南粳稻生產區，每年稻瘟病發生面積都在133.3萬hm2以上，所造成的產量損失非常慘重[2]。使用化學農藥雖然在一定程度上可控制該病害，但增加了農民的生產成本，而且帶來了嚴重的環境污染和生態失衡等問題。轉基因技術能突破生物種間障礙，實現物種間基因的轉移，為水稻的抗病育種帶來了新契機。利用轉基因技術將抗稻瘟病基因導入栽培稻，培育高抗性品種，是目前防控該病害最經濟、有效和安全的途徑。【前人研究進展】水稻轉基因抗病育種成功與否，很大程度上依賴于有效的遺傳轉化方法的開發和應用。目前水稻的轉基因方法以農桿菌介導法為主，利用該方法已成功獲得了一些優良的抗病蟲轉基因水稻材料[3-8]。然而該轉化法主要依賴受體細胞的脫分化和再分化過程獲得轉基因植株，明顯地存在操作繁瑣且周期長、易發生體細胞變異、轉化植株常出現基因沉默、轉化效率低等缺陷[9-12]，這無疑是通過基因轉化進行水稻品種改良和功能基因組研究的極大障礙。真空滲透法(Vacuum infiltration)是一種無需經過組織培養，只需對開花早期的活體植株抽真空處理即可直接獲得轉化種子的原位轉基因方法。與傳統的農桿菌介導法相比，該方法具有簡便、快速、可靠、高效等優點，為水稻等植物的基因轉化開辟了新途徑[11-13]。自1993年Bechtold等首次利用該法在擬南芥中成功轉化以來，隨后該方法在矮牽牛、豆科植物、棉花、白菜、芥菜、蘿卜、煙草、油菜、獼猴桃等多種植物上也實現了成功轉化[14-27]。此外，水稻的抗稻瘟病育種還面臨稻瘟病菌變異快、現有栽培稻抗源面窄和優良抗源少等難題，從稻屬以外的生物中發掘新的抗稻瘟病基因具有重要意義。【本研究切入點】課題組前期從苦參塊根中分離克隆到一種對水稻稻瘟病菌(PiriculariaoryzaeCav.)具有明顯抑制作用的凝集素蛋白(Sophora flavescens Lectin，SFL)基因[28]，該基因的表達可以提高水稻對稻瘟病的抵御能力，可作為一個新的抗稻瘟病基因源進行發掘和利用。真空滲透法無需組培過程，具有簡便、快速、高效等優點，但目前該法在水稻遺傳轉化上的應用研究未見報道。【擬解決的關鍵問題】首次應用真空滲透法，將苦參凝集素蛋白基因SFL轉入云南粳稻品種‘云資粳41號’，獲得抗稻瘟病能力提高轉SFL基因水稻材料，建立水稻的農桿菌-真空滲透轉化體系，為水稻等作物的基因轉化提供了一條快速、有效的新途徑，同時也為今后SFL基因的功能研究及抗稻瘟病水稻新品種的培育奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 受體材料

水稻受體品種為云南粳稻品種‘云資粳41號’，該品種是元江普通野生稻與栽培稻‘合系35’的雜交后代，具有大穗、著粒密度高、粒寬、株型好等特性，但是抗稻瘟病能力較差。根據預定的轉化時間，提前在溫室進行生長狀態較佳、健壯的待轉化水稻受體材料的分批培養。將‘云資粳41號’種子浸種5 h后，直接播種于裝有水稻土的培養桶內，出苗后進行壯苗30～40 d，再分栽于裝有適量水稻土的培養桶內培養50～60 d，待長至抽穗期便可直接取用進行轉化。

1.2 質粒、菌株及真空裝置

含目的基因的表達載體質粒pCAMBIA1300-SFL(bar)為本實驗室構建和保存，選擇標記基因為bar基因。農桿菌LBA4404為本實驗室保存。云南稻瘟病菌生理小種16t由云南農業大學李成云教授惠贈。

真空滲透裝置為自主研制的水稻真空滲透轉化裝置(詳見國家發明專利 “一種水稻遺傳轉化真空滲透轉化裝置”專利號：ZL201410467839.6)以及津騰GM-0.33B隔膜真空泵等。

1.3 真空滲透轉化及轉化子篩選

1.3.1 農桿菌滲透轉化液的制備 將保存的農桿菌菌液劃線接種于含相應抗生素的YEP 平板上，28 ℃培養24～48 h。挑取長出的單菌落接種于含相應抗生素的10 mL YEP 液體培養基中，28 ℃，200 r/min振蕩培養48 h，然后將菌液轉入 2 L 不含抗生素的 YEP 培養基中，繼續培養至 OD600為1.0左右，室溫下4000 r/min離心5 min，收集菌體，菌體用滲透培養液(1/2MS液體培養基+ As 19.6 mg/L+ Silwet L-77200 μl/L +蔗糖50 g/L，pH 5.8)重懸調節OD600為0.8，作為含目的基因的農桿菌滲透轉化液備用。

1.3.2 真空滲透轉化及栽培管理 提前將待轉化水稻植株培養桶內的水瀝干，用袋子把植株和土進行包裹，以防土滲漏。留下適宜轉化期的水稻分蘗枝，其余分蘗全部剪除；裝置的固定、連接和密封具體參照國家發明專利 “一種水稻遺傳轉化真空滲透轉化裝置”(專利號：ZL201410467839.6)中的相關描述；將水稻連同培養桶整個倒置在容器的環狀承接臺上，使植株稻穗自然下垂；將轉化液置于真空滲透裝置中；調節轉化液盛放器的高度使植株的花序部分完全浸于含菌體的滲透培養液中；蓋上容器頂蓋，關閉排氣閥，將真空泵上的真空管和進氣閥連接，打開真空泵開關，抽真空。0.05 MPa，維持10 min，轉化完成，立即關閉真空泵開關，緩慢打開閥門，待容器恢復常壓，打開蓋板，取出植株。

將轉化后的水稻植株置于溫室，覆膜保濕2～3 d后，按常規栽培方法繼續培育植株至成熟(約30～40 d)，收獲T0代轉化種子，干燥后保存備用。

1.3.3 抗性轉化株的篩選 進行不同濃度的受體材料Basta噴施實驗，確定轉化子的最佳篩選濃度。3次噴灑確定濃度的除草劑 Basta(phosphinotricin，原液濃度為10 %)水溶液以篩選抗性株：將收獲的T0代種子，播種在盆缽中，每盆約播種100 粒。出苗后，常規管理，待幼苗生長到子葉完全展開時開始第1次噴灑，5～7 d后第2次噴灑，再過5～7 d后第3次噴灑，最后存活的植株定為抗性株。統計抗性株數，按公式(1)計算轉化率：

轉化率(%)=抗性株數/T0代種子數×100

(1)

1.4 抗性株的檢測以及抗性鑒定

1.4.1 抗性株的氯酚紅檢測 以未做轉化的‘云資粳41號’植株為對照，從利用 Basta 鑒定篩選出的抗性株中，隨機挑出部分轉化株，剪取葉片放置于氯酚紅反應液(MS + 15 μmol/L 6-BA + 0.5 μmol/L NAA + 50 mg/L CR + 5.0 mg/L PPT，pH值 6.0)中，28 ℃暗培養3～5 d后觀察顏色變化。

1.4.2 抗性株的PCR檢測 采用 CTAB 法提取部分抗性株幼嫩葉片的基因組 DNA，以ddH2O為空白對照，非轉化植株為陰性對照，以pCAMBIA-SFL(bar)質粒為陽性對照，進行外源基因(SFL)和標記基因(bar)的PCR擴增鑒定，PCR檢測目的基因的整合情況。SFL基因上游引物SFL-1(5’-AACCCAA AGTCATAGTTGCAT-3’)和下游引物SFL-2(5’-GCTCTACACCATGGATAACT-3’)；Bar基因引物上游引物Bar-1(5’-CCGCTCGAGGATCTACCATGAGCCCAGAAC-3’)和下游引物Bar-2(5’-CCGCTCGAGCGGGTCATCAGATCTCGGTGA -3’)。PCR擴增體系為25 μl：ddH2O 15.75 μl，DNA 1 μl，10 mmoL/L引物各1 μl，10×PCR buffer 2.5 μl，dNTP (2.5 mmol/L) 2 μl，MgCl2(25 mmol/L)1.5 μl，rTaqDNA聚合酶(5 U/μl)0.25 μl。PCR 擴增程序為:95 ℃ 預變性 5 min； 94 ℃ 變性 45 s，48 ℃(SFL)或53 ℃(Bar)退火 45 s，72 ℃延伸1.5 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.3 轉基因植株的抗稻瘟病鑒定 稻瘟病菌產孢：先將活化的稻瘟病菌絲接種于PDA液體培養基中(土豆200 g/L+葡萄糖40 g/L，pH 5.8)， 25～28 ℃培養4～5 d后，吸取適量菌液均勻地涂布接種于番茄燕麥培養基上(燕麥片40 g/L+番茄汁200 mL/L+CaCO30.6 g/L+瓊脂18 g/L，pH 5.8)，25～28 ℃，弱光下進行產孢培養7～10 d。

稻瘟病菌苗期噴霧接種：將所有鑒定材料浸種、催芽后播于裝有水稻土的育苗盤中，每個材料2 次重復。當苗齡達3 葉1心期時，制備濃度為2×105個/mL的孢子懸浮液，加1滴吐溫20作展布劑，進行噴霧接種。接種后置于25～28 ℃，保濕以利于發病，7～10 d 后調查發病情況。以非轉基因水稻和易感蒙古稻作為對照，病情鑒定的方法按國際水稻所公布的抗性分級標準進行。

稻瘟病菌大田人工誘發鑒定：在隔離基地田間種植苗期抗病的T2代材料，用當地稻瘟病高發田塊中采集的感病株進行稻瘟病誘發鑒定，四周種植感病品種蒙古稻，7～10 d左右調查發病情況，病情鑒定的方法按國際水稻所公布的抗性分級標準進行。

2 結果與分析

2.1 水稻的真空滲透轉化

本研究應用自主研制的水稻真空容器，以含SFL基因的pCAMBIA-SFL(bar) 表達載體作為外源片段，取用生長健壯的抽穗期‘云資粳41號’活體水稻植株作為受體，0.05 Mpa條件下抽真空10 min即實現了外源SFL基因向受體水稻植株的原位轉化(圖1)。共計處理水稻受體10株，每株平均3個分蘗枝，收獲T0代種子12 650粒。

圖1 正在進行真空滲透轉化的水稻受體植株Fig.1 The recipient rice plant in situ undergoing vacuum infiltration transformation

圖2 部分轉化株的除草劑抗性篩選結果Fig.2 The screening results of herbicide resistance of the partial transformed plants

2.2 抗性轉化株的篩選

根據受體材料對不同濃度的除草劑Basta的噴施反應(圖2上)，確定轉化子的篩選濃度為20 mg/L，部分轉化株的除草劑噴施實驗結果如圖2下所示，非抗性株在噴藥后 2～3 d，葉片便開始枯萎，后來整個植株枯死。抗性株由于有bar基因的表達產物，能夠分解 PPT 而除去毒性，生長照常不受影響。通過除草劑噴施實驗共篩選獲得135株抗性苗，平均抗性苗為13～14苗/株。

2.3 轉基因植株的檢測以及抗性鑒定

2.3.1 抗性株的氯酚紅檢測 對除草劑抗性株進行氯酚紅檢測，通過顏色的反應可初步判定是否為陽性轉基因植株。部分轉化株的氯酚紅鑒定結果表明，轉基因抗性植株因為有bar基因的表達，能夠分解 PPT，沒有影響離子的代謝，因呼吸作用產生二氧化碳，導致 pH 值下降，顏色由紅變為黃色或者橙黃色；非轉化株則不同，由于不能分解 PPT 而代謝出氨,導致 pH 值升高，顏色不變或者由紅色變為紫紅色(圖3)。經統計，135株除草劑抗性苗中，氯酚紅陽性株為116株。氯酚紅檢測法操作快速簡便，觀測結果直觀，可在早期對轉基因植株進行初篩，大大節約篩選成本并且提高效率。

2.3.2 抗性株的PCR鑒定 對經氯酚紅檢測的抗性株進行PCR檢測以確認目的基因是否轉入受體植株。部分抗性株的PCR擴增檢測結果表明，抗性轉化株中可擴增出與pCAMBIA-SFL(bar)質粒相同大小的1000 bp左右的SFL基因片段和560 bp左右的bar基因片段，而未轉化陰性對照則無擴增條帶(圖4和5)，表明外源DNA已整合到轉化植株基因組中。經氯酚紅檢測的116株陽性苗中，經PCR檢測，還是存在一定數量比例的假陽性苗(圖4上)。說明氯酚紅檢測法存在一定的局限性，只適于早期對轉基因苗進行初步鑒定。相比之下，PCR檢測結果更準確可靠。本研究收獲的12 650粒T0代種子中，最終經PCR檢測確定的轉基因陽性苗為98株，轉化率為0.77 %。

1:氯酚紅反應液；2～3:非轉基因植株葉片；4～9:轉SFL基因植株的葉片1: Chlorophenol red reaction solution; 2-3: Non-transgenic plant leaves; 4-9:Transgenic leaves of SFL gene plants圖3 部分轉基因植株葉片的氯酚紅顯色鑒定Fig.3 Identification of chlorophenol red in leaves of some transgenic plants

上-M: DL2000; 1: 陽性對照; 2:H2O空白對照；3:陰性對照；4～17:轉基因植株; 下-M: DL2000; 1:H2O空白對照；2:陽性對照；3:陰性對照；4～17:轉基因植株Above-M:DL2000; 1:Positive control; 2:H2O blank control; 3: Negative control; 4-17:Transgenic plants; Below-M:DL2000; 1: H2O blank control; 2:Positive control; 3:Negative control; 4-17: Transgenic plants圖4 部分轉基因植株SFL基因PCR檢測電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of SFL gene in some transgenic plan

M:DL2000; 1:H2O空白對照；2:陽性對照；3:陰性對照；4～17:轉基因植株M:DL2000; 1:H2O blank control; 2:Positive control; 3:Negative control; 4-17:Transgenic plants圖5 部分轉基因植株bar基因PCR檢測電泳圖Fig.5 Electrophoretogram of bar gene in some transgenic plants by PCR detection

2.3.3 轉基因植株的抗稻瘟病鑒定 以非轉基因水稻植株和易感品種蒙古稻植株作為對照，在溫室對經PCR檢測的98株陽性T1代轉基因水稻植株進行苗期稻瘟病菌噴霧接種鑒定。部分植株的抗稻瘟病鑒定結果如圖6所示，易感對照蒙古稻發病情況比較嚴重，逐漸萎蔫枯死。與非轉基因植株對照相比，轉基因植株出現病斑的時間較晚，病斑的擴展速度很慢，病斑比較小，能保持正常生長，說明轉SFL基因的植株抗稻瘟病能力較非轉基因植株明顯提高。經苗期噴霧鑒定，最終篩選出稻瘟病抗性較強的轉基因材料25份。

用當地稻瘟病高發田塊中采集的感病株對種植于隔離基地大田間的T2代材料進行稻瘟病誘發鑒定，結果如表1所示，根據抗感情況最終篩選出具有較穩定抗稻瘟病能力的轉SFL基因水稻新材料12份。

CK1：感病蒙古稻；CK2：非轉基因對照‘云資粳41號’；1～5：轉基因植株CK1: Susceptible Mongolian rice; CK2: Non-transgenic control ‘Yunzijing 41’; 1-5: Transgenic plants圖6 部分轉基因植株的抗稻瘟病鑒定Fig.6 Identification of resistance to rice blast in some transgenic plants

材料編號Material number發病級別Incidence level抗性評價Resistance evaluation材料編號Material number發病級別Incidence level抗性評價Resistance evaluationST11R ST141RST23MR ST151RST33MR ST161RST41R ST173MRST51R ST183MRST64MS ST194MSST71R ST201RST81R ST213MRST93MR ST221R ST104MS ST233MR ST114MS ST241R ST125S ST253MR ST131R云資粳41(受體對照)7S蒙古稻(感病對照)8HS

3 討 論

真空滲透法是一種在植株原位真空滲入條件下所進行的農桿菌介導的遺傳轉化方法。目前該方法在擬南芥、油菜、芥菜、煙草、蘿卜、獼猴桃、豆類、棉花等多種植物上已成功應用。在目前的真空滲透法有關研究報道中，應用多為擬南芥、芥菜、白菜等小型植物，且轉化率普遍偏低，真正獲得的有應用價值的轉基因植物較少。這可能與現有真空容器容量較小以及真空滲透轉化過程時因現有容器容量空間有限，多采用將受體植株挖出，將其直接倒放于容器中進行轉化，轉化完成后又移栽定植的轉化操作方法有關[16-17,20-21,24-26]，這種操作方式一方面并不是真正的原位轉化，另一方面明顯對轉化后植株的生長狀態、健壯程度和結實率有影響。此外，因真空容器中無固定部件很容易出現花序脫落或側枝被壓斷，進而造成部分種子丟失，最終收獲的轉化子少。盡管根據該方法的原理和技術特點，該方法更傾向適用于個體較小、基因型依賴嚴重、組培困難的作物，但其具有操作簡便快速、無遺傳變異、轉基因后代遺傳一致性好、轉化效率較高等獨特優勢是其它轉基因方法所不可比擬的，即便對組培較容易的水稻等個體較大作物也值得嘗試和探索。

本研究應用自主研制的水稻真空滲透轉化裝置，快速實現了外源SFL基因向受體水稻的原位轉化。收獲的T0代轉化種子，經抗性篩選、檢測以及鑒定后成功獲得了一批具有抗稻瘟病能力的轉基因植株。真空滲透法是在水稻上的初步嘗試，但證實了該方法的可行性和實用性。真空時間、真空強度、滲透培養基、菌液濃度、轉化時期等各種轉化條件的優化及轉基因后代材料的遺傳穩定性等方面還有待進一步研究，以期真正建立起穩定高效的水稻真空滲透轉化技術體系，為水稻及其它作物的基因轉化提供技術參考。

4 結 論

真空滲透法應用于水稻的轉化研究尚屬首次應用，直接對開花前的活體水稻進行短暫抽真空處理，快速將苦參凝集素蛋白基因(SFL)成功轉入水稻，并獲得具有抗稻瘟病能力的轉基因植株。這為水稻及其它作物的基因轉化提供了另一重要途徑，為品種的遺傳改良和基因功能研究提供了強有力的技術保障。