堿性土上GF677 與毛桃葉片葉綠素合成及葉綠體結構差異性研究

宋海巖，陳 棟，李 靖，鐘小江，楊文淵，祝 進，江國良*

(1.四川省農業科學院園藝研究所·農業部西南地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，四川 成都 610066;2.宜賓縣農業局果樹站，四川 宜賓 644600; 3.四川省園藝推廣總站，四川 成都 610016)

【研究意義】四川盆地是我國桃主要栽培地區之一。近年來，受早春干旱、夏季暴雨以及長期的土壤養分消耗因素影響，龍泉山脈和川中丘陵產區桃樹黃化現象有愈演愈烈趨勢，部分桃園黃化植株比例高達90 %，對桃產量和品質影響較大，已成為當地桃產業健康發展的重要限制因子之一[1-2]。GF677 (P.amygdalus×P.persica)桃砧木由法國INRA(Institut Nationaldela Recherche Agronomique)于20世紀60年代雜交選育而成，根系發達，長勢健壯，樹冠高大與桃/油桃品種間嫁接親和力強，并具有抗鈣質堿性土缺鐵性黃化、耐重茬、耐旱等優良特性[3]。目前關于GF677的研究主要集中于組培快繁技術上[4-11]，為GF677的大規模推廣提供了生產條件，但是GF677作為栽培所需的桃砧木品種，其抗鹽堿能力及引入國內的適應性表現應該是我們需要研究的主要內容，尤其是在鹽堿地或重茬園區的研究，這對開展桃砧木抗性育種具有重要意義。【前人研究進展】郁萬文等人[12-13]對GF677在鹽脅迫和淹水脅迫下的表現研究表明：不同樹種/品種的桃砧耐鹽性排序為蒙古扁桃>山桃>GF677>毛桃>甘肅桃>陜甘山桃>筑波5號>毛櫻桃，同時GF677抗水淹能力也一般。但是GF677在四川盆地石灰性紫色土地區栽培條件下表現出極強的抗黃化特性。【本研究切入點】本試驗對GF677在石灰性紫色土上葉片葉綠素合成及葉綠體結構進行對比研究。【擬解決的關鍵問題】以期找出其葉綠素代謝和葉綠體結構差異，為未來抗性桃砧木育種中優良親本的篩選和選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗地點

供試材料為抗性桃砧木GF677(扦插苗)，以普通毛桃(實生苗)為對照。

1.2 試驗方法

選取生長勢一致的GF677與毛桃實生苗，單株為1重復，每個處理設置5個重復。自3月10日起每隔1個月左右從每株樹上選取樹冠各方位、無病蟲害新梢中部成熟功能葉10片，拍照后放入液氮帶回實驗室進行生理生化指標測定及葉綠素合成前體含量測定。

葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量：使用丙酮法，參照李合生等[15]。

葉綠素各合成前體含量測定：5-氨基酮戊酸(ALA)含量、膽色素原PBG含量參照D Mauzerall[16]等人方法；Mg-ProtoⅨ、ProtoⅨ、Pchl使用堿性丙酮提取法，參照劉和平[17]等人方法；UrogenⅢ含量測定參照楊清等人[18]的方法。

2 結果與分析

2.1 不同時期葉片葉綠素各組分含量變化

由圖1可知，堿性土上不同時期GF677葉片和毛桃葉片葉綠素a含量均呈現先下降后上升最后又下降的趨勢，但毛桃在受到堿脅迫后葉綠素a含量下降幅度更大，導致整個生長期毛桃葉片葉綠素a含量始終低于GF677，7月29日至9月29日葉綠素a含量的上升可能與GF677和毛桃對堿性土壤的適應所致。在5月5日和5月27日至9月29日之間GF677葉綠素a含量均極顯著(P<1 %)高于毛桃，GF677葉片葉綠素a含量最低值出現在5月27日，最高值出現在7月29日，而毛桃葉片葉綠素a含量最高值出現在5月5日，最低值出現在7月29日。

由圖2可知，堿性土上GF677葉片葉綠素b含量呈現先下降后迅速上升然后又下降最后再略微上升的趨勢，在5月5日和5月27日至9月29日之間葉綠素b含量均極顯著(P<1 %)高于毛桃，葉綠素b含量最低值出現在5月5日，最高值出現在5月27日，而毛桃葉片葉綠素b含量呈現先上升后下降然后又上升最后再下降的趨勢，最高值出現在5月5日，最低值出現在9月29日。GF677葉綠素b含量在5月5日略微下降后能夠迅速恢復，毛桃在受到堿脅迫后葉片葉綠素b含量下降極為顯著，因此推測毛桃在堿性土上的黃化可能與葉片葉綠素b含量的下降有關。

圖中**表示該時期同一指標在P<1 %水平上差異顯著，*表示該時期同一指標在P<5 %水平上差異顯著，下同** in the picture indicators in P<1 % significant level in the same period and * in the picture indicators in P<5 % significant level in the same period，the same as below圖1 堿性土上GF677和毛桃不同時期葉片葉綠素a含量變化Fig.1 Content of chla in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

圖2 堿性土上GF677和毛桃不同時期葉片葉綠素b含量變化Fig.2 Content of chlb in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

由圖3可知，堿性土上GF677葉片類胡蘿卜素(Cx·c)含量呈現先上升后下降然后又上升最終趨于平緩的趨勢，其中在3月10日測定時GF677葉片Cx·c含量顯著(P<5 %)低于毛桃葉片，然而之后GF677葉片Cx·c含量呈現更明顯的增加趨勢，并在5月5日顯著(P<5 %)高于毛桃葉片，隨后GF677葉片Cx·c含量呈現更明顯的下降趨勢，在5月27日和6月29日GF677葉片Cx·c含量極顯著(P<1 %)低于毛桃，最低值出現在3月10日，毛桃葉片類胡蘿卜素含量最低值也出現在3月10日。6月29日后GF677與毛桃葉片類胡蘿卜素的上升可能與葉片的成熟與衰老有關。

由圖4可知，堿性土上GF677葉片葉綠素總量變化呈現先下降后上升最后又下降的趨勢，其中在3月10日和5月27日至9月29日均極顯著(P<1 %)高于毛桃葉片，葉綠素總量最低值出現在5月5日，最高值出現在7月29日。而毛桃葉片葉綠素總量呈現先略微上升后下降然后又上升最后再下降的趨勢，最高值出現在5月5日，而最低值出現在7月29日。

圖3 堿性土上GF677和毛桃不同時期葉片類胡蘿卜素含量變化Fig.3 Content of carotenoid in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

圖4 堿性土上GF677和毛桃不同時期葉片葉綠素總量變化Fig.4 Content of total chlorophyll in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

由圖5可知，堿性土上GF677葉片葉綠素a/葉綠素b比值變化呈現先上升后下降然后又上升最后再下降的趨勢，在5月5日顯著(P<5 %)低于毛桃，在5月5日至7月29日和9月29日均極顯著(P<1 %)低于毛桃，最低值出現在5月27日，最高值出現在9月2日。而毛桃葉片葉綠素a/葉綠素b比值呈現先下降后上升然后又下降最后再上升的趨勢，最低值出現在5月5日，最高值出現在9月29日，9月29日出現最高值可能與毛桃葉片的衰老及葉綠素b的分解有關。

2.2 不同時期葉片葉綠素合成前體含量變化

圖6為被子植物體內葉綠素合成途徑，在葉綠素合成的15個步驟中，關鍵步驟包括Glu(Glutamate,谷氨酸)→ALA(Aminolevulinic acid, 氨基酮戊酸)→PBG(Porphobilinogen, 膽色素原)→Uro (Uroorphyrinogen, 尿卟啉)→Proto(Protoporphyrin, 原卟啉)→Mg-Proto (Mg-Protoporphyrin, 鎂原卟啉)→Pchl(Protochlorophyll, 原葉綠素酸)→Chla(Chlorophyll a,葉綠素a)→Chlb (Chlorophyll b, 葉綠素b)，其中任何一步受阻都將影響葉綠素的生物合成[19-24]，選取6種關鍵物質對其含量進行動態測定。

圖5 堿性土上GF677和毛桃不同時期葉片葉綠素a/b比值變化Fig.5 Ratio between chla and chlb in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

箭頭旁阿拉伯數字代表調控該步驟的酶The arrow next to the Arabic numerals indicators regulatory enzyme in the process圖6 被子植物葉綠素合成途徑(參考Beale,2005)Fig.6 The chlorophyll biosynthesis pathway in angiosperms(quoted from Baele 2005)

由圖7可知，堿性土上GF677葉片5-氨基酮戊酸含量(ALA)呈現先下降后上升的趨勢，5月5日第一次測定時略微低于毛桃葉片ALA含量，但差異不顯著，之后下降到5月27日顯著(P<5 %)低于毛桃，6月29日至7月29日繼續下降并極顯著(P<1 %)低于毛桃，最低值出現在7月29日，之后隨著毛桃葉片ALA含量的下降，在9月2日至9月29日GF677葉片ALA含量極顯著(P<1 %)高于毛桃葉片。而毛桃葉片ALA含量呈現先上升后下降的趨勢，最高值出現在6月29日，這可能與該時期葉片黃化及ALA代謝受阻有關。

圖7 堿性土上GF677和毛桃不同時期葉片5-氨基酮戊酸含量變化Fig.7 Content of 5-aminolevulinic acid in leaves of GF677 and wild peach on alkline soil during different periods

圖8 堿性土上GF677和毛桃不同時期葉片膽色素原含量變化Fig.8 Content of PBG in leaves of GF677 and wild peach on alkline soil during different periods

由圖8可知，堿性土上GF677與毛桃葉片膽色素原(PBG)含量均呈現先上升后下降然后又上升的趨勢，最高值都出現在7月29日，但略有不同，在5月27日至6月29日間GF677葉片PBG含量顯著(P<5 %)高于毛桃葉片。

由圖9可知，堿性土上GF677葉片內尿卟啉Ⅲ(UrogenⅢ)含量呈緩慢上升趨勢，且一直極顯著(P<1 %)高于毛桃，而毛桃葉片內UrogenⅢ含量呈現先上升后略微下降的趨勢，毛桃與GF677葉片內各種葉綠素合成前體由尿卟啉Ⅲ開始出現較大差異。

圖9 堿性土上GF677和毛桃不同時期葉片尿卟啉原Ⅲ含量變化Fig.9 Content of UrogenⅢ in leaves of GF677 and wild peach on alkline soil during different periods

圖10 堿性土上GF677和毛桃不同時期葉片原卟啉Ⅸ含量變化Fig.10 Content of ProtoⅨ in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

由圖10可知，堿性土上GF677與毛桃葉片原卟啉Ⅸ含量均呈現先上升后下降然后又上升最后再下降的趨勢，在5月27日至9月29日5個時期均極顯著(P<1 %)高于毛桃，GF677葉片原卟啉Ⅸ含量最低值出現在3月10日，最高值出現在7月29日，而毛桃葉片原卟啉Ⅸ含量最低值出現在7月29日，最高值出現在5月5日。

由圖11可知，堿性土上GF677葉片鎂原卟啉Ⅸ含量呈現先上升后略微下降然后再上升最后又下降的趨勢，在5月27日至9月29日均極顯著(P<1 %)高于毛桃，GF677葉片鎂原卟啉Ⅸ含量最低值出現在3月10日，最高值出現在7月29日，而毛桃葉片鎂原卟啉Ⅸ含量呈現先略微上升后下降然后又上升最后再下降的趨勢，最低值出現在7月29日，最高值出現在5月5日。

由圖12可知，堿性土上GF677葉片原脫植基葉綠素(Pchl)含量呈現先上升后下降然后又上升最后再下降的趨勢，雖然在3月10日第一次測定時GF677葉片Pchl含量顯著低于毛桃，而在5月27日至9月29日均極顯著(P<1 %)高于毛桃，最低值出現在3月10日，最高值出現在7月29日，而毛桃葉片原脫植基葉綠素含量呈現先略微上升后下降然后又上升最后再下降的趨勢，最高值出現在5月5日，最低值出現在7月29日。

圖11 堿性土上GF677和毛桃不同時期葉片鎂原卟啉Ⅸ含量變化Fig.11 Content of Mg-ProtoⅨ in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

圖12 堿性土上GF677和毛桃不同時期葉片原脫植基葉綠素含量變化Fig.12 Content of Pchl in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

2.3 葉片葉綠素各組分及葉綠素前體間相關性分析

圖13為葉綠素a/b間循環路徑圖[13]，表1為GF677、毛桃葉片葉綠素各組分及葉綠素前體間相關性分析?；趫D6高等植物葉綠素合成途徑，推測對于正常植株體內這些葉綠素組分(除類胡蘿卜素)與其合成前體的變化應該呈現正相關關系，然而根據對堿性土上GF677和毛桃葉綠素各組分及合成前體之間相關性分析(表1)發現，毛桃在這幾個步驟中的PBG→Uro和Uro→Proto出現負相關系數-0.413和-0.148，其余步驟均呈正相關系數。而GF677在這幾個步驟中的PBG→Uro過程相關系數為-0.908，達顯著負相關(P<5 %)，在Uro→Proto和Chla→Chlb這兩個步驟相關系數分別為-0.599和-0.391，其余步驟均呈正相關系數。結合對各葉綠素組分及合成前體含量的分析結果(圖7～12)，推測毛桃在PBG向Uro合成步驟及Uro向Proto合成步驟轉化受阻，而GF677與毛桃葉綠素合成前體含量開始出現較大差異正好從Uro開始，并且毛桃葉片內Uro含量始終極顯著低于GF677。而結合葉綠素a/b間循環途徑，我們推測GF677葉片內葉綠素前體合成受阻時Chla能夠向Chlb轉化一部分，從而保證正常生長所需的Chlb含量，而毛桃Chla降低時Chlb隨之而明顯降低，這可能是GF677在Chla→Chlb步驟出現負相關性的原因。

3 討 論

植物在受到鹽堿脅迫時葉片葉綠素代謝會受阻，葉綠素合成某些前體(如ALA、PBG等)會積累在植物體內[26]。GF677葉片葉綠素a含量、葉綠素b含量以及葉綠素總量在均大于毛桃，尤其是GF677在受到堿脅迫時葉片葉綠素b含量可以看到先下降后又重新增加，而毛桃葉片葉綠素b合成在受阻后在5月27日至7月29日均極顯著(P≤1 %)低于GF677，表明在受到堿脅迫后，GF677葉片葉綠素b合成途徑沒有受到阻礙，而毛桃葉綠素b含量下降可能是其葉片出現黃化的主要原因。而賈俊麗等人[27]對桑樹斑葉突變體的葉綠素合成特性研究表明突變體葉片黃化部分的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均有不同程度的下降，其中葉綠素a的減少最顯著，可能是導致突變體葉色黃化的直接原因，并未分析葉綠素a、b之間可能存在的聯系以及葉綠素b與突變體葉色黃化之間的關系。

Chl.葉綠素; Chlide.脫植基葉綠素;CS.葉綠素合酶; Chlase.葉綠素分解酶; CAO.葉綠素加氧酶; CBR.葉綠素b還原酶; CAR.葉綠素a還原酶Chl.chlorophyll; Chlide.chlorophyllide;CS.chlorophyll synthase; Chlase. chlorophyllase; CAO.chlorophyllide a oxygenase; CBR.chlorophyll(ide) b reductase; CAR.hydroxy-chlorophyll(ide) a reductase圖13 葉綠素循環(參考W. Rüdiger，2002)Fig.13 The chlorophyll cycle(quoted from W. Rüdiger，2002)

對堿性土上GF677和毛桃葉片葉綠素合成前體進一步研究發現，毛桃葉片ALA含量在受到堿脅迫后會先上升后下降，在葉片內出現積累，UrogenⅢ含量一直極顯著低于GF677，表明其ALA向PBG轉化步驟及PBG向Uro轉化步驟在受到堿脅迫時受阻。王穎等人[28]和孫錦等人[29]對菠菜在鹽脅迫下的葉綠素合成前體研究也表明PBG向Uro轉化步驟在受到鹽脅迫時受阻。張麗等人[30]對鹽堿脅迫下番茄幼苗葉綠素合成前體的影響也表明PBG向Uro轉化步驟受阻，噴施Spd后可緩解部分步驟。而GF677葉片內ProtoⅨ、Mg-ProtoⅨ以及原脫植基葉綠素含量在受到堿脅迫后短時間下降之后又重新升高，表明GF677在堿性土上具有更強的適應能力，在受到堿脅迫后能在較短時間內調整葉綠素前體的合成。

結合對各葉綠素組分及合成前體含量的分析結果，認為毛桃在PBG向Uro合成步驟及Uro向Proto合成步驟轉化受阻，而GF677與毛桃葉綠素合成前體含量開始出現較大差異正好從Uro開始，毛桃葉片內Uro含量始終極顯著低于GF677，表明PBG向Uro步驟及Uro向Proto步驟對桃砧木抗黃化能力的差異分化具有重要意義。調控這幾個步驟的關鍵酶[31]是：羥甲基后膽色素原合酶(hydroxymethylbilane synthase)[膽色素原合酶脫氨酶(Porphobilinogen deaminase)]、尿卟琳原Ⅲ合酶(uroporphyrinogenⅢ synthase)[尿卟琳原Ⅲ共合酶(uroporphyrinogenⅢ co-synthase)]、尿卟琳原脫羧酶(uroporphyrinogen decarboxylase)、糞卟琳原氧化脫羧酶(coproporphyrinogen oxidative decarboxylase)、原卟琳原氧化酶(protoporphyrinogen oxidase)，對這些酶以及調控這些酶相關基因的表達進行探究，將會為我們進一步了解GF677抗黃化機制提供依據。

表1 GF677、毛桃葉片葉綠素各組分及葉綠素前體間相關性分析

注：以對角線為界，右上方為GF677，左下方為毛桃，*表示相關性達0.05顯著性水平，**表示相關性達0.01顯著性水平，下同。

Notes: The upper right is on behalf of GF677 and the bottom left is on behalf of wild peach,divided by a diagonal line.* indicators inP≤5 % significant level,**indicators inP≤1 % significant level,the same as below.

Chla和Chlb之間的相互轉化稱為“葉綠素循環”，在不同生理條件下調控它們之間的比值具有重要的意義[32]。Klein等人[33]認為質體核糖體反應中心新生肽(RCs)對葉綠素a有更高的親合性，葉綠素b是由葉綠素a氧化而來,所以當RCs不再整合葉綠素a時,富余的葉綠素a才有部分氧化成葉綠素b。部分葉綠素a合成的減少，將會擴大對葉綠素b合成的抑制[34]，導致葉綠素a/b比值升高，這與本試驗中觀察到的毛桃葉片內葉綠素a、葉綠素b合成同時受到抑制相一致。葉綠素b減少也會導致光合單元減少和葉綠體類囊體膜的發育不良。GF677葉片內葉綠素前體合成受阻時葉綠素a含量短暫降低時葉綠素b含量反而會上升，據此推測GF677葉片內葉綠素前體合成受阻時Chla能夠向Chlb轉化一部分，從而保證正常生長所需的Chlb含量，這可能是GF677在Chla→Chlb步驟出現負相關性的原因。而毛桃Chla降低時Chlb隨之而明顯降低。結合圖13，今后對調控Chla→Chlb轉化的中間產物(7-羥甲基葉綠素酸脂a、葉綠素酸脂a、葉綠素酸脂b等)及相關酶(CAO，CS，Chlase等)活性的分析將有助于進一步探究毛桃調控毛桃葉片Chla→Chlb受阻的原因。

4 結 論

本研究以抗性桃砧木資源GF677和普通毛桃為試驗材料，比較其在堿性土上葉綠素合成途徑各個步驟的前體及組分含量差異，并分析其組分間相關系數。最終發現：①在5-10月份多數測定時期，堿性土上GF677葉片葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量及UrogenⅢ、ProtoⅨ、Mg-ProtoⅨ和原脫植基葉綠素含量均高于毛桃；GF677葉片內葉綠素b、ProtoⅨ、Mg-ProtoⅨ以及原脫植基葉綠素含量在受到堿脅迫后能在短時間內恢復甚至超越前期值，而毛桃葉片葉綠素a、b合成受阻后急劇下降，結合對各葉綠素組分及合成前體含量的分析結果，因此毛桃葉綠素b含量下降可能是其葉片黃化的主要原因。②植物葉綠素合成PBG→Uro、Uro→Proto兩個步驟，及葉綠素循環中葉綠素a→葉綠素b轉化是否受阻是桃砧木抗黃化能力的重要判斷指標。本試驗為今后桃砧木育種工作中的篩選高鐵吸收效率親本提供了基礎性工作。