4個抗稻瘟病基因在秈稻資源中的分布

李培江，張選明，沙志鴻，劉志奇，周 凱，嚴洪慶，顧朝軍

(陜西省水稻研究所，陜西 漢中 723000)

【研究意義】水稻(Oryzasativa)是我國重要的糧食作物之一，由子囊真菌(Magnaporthegrisea)引起的稻瘟病已成為水稻高產穩產的嚴重阻礙，其危害面積與危害程度日趨嚴重[1-2]。實踐證明，選育抗性品種是防治稻瘟病最經濟、有效的方法，而鑒定和篩選品種資源的抗瘟基因型是選育抗性品種的首要前提[3]。【前人研究進展】隨著分子標記技術的發展，越來越多的國內外學者對抗稻瘟病基因做出報道，截至2015年3月，已至少報道了69個抗稻瘟病位點共84個主效基因。其中，Pita、Pib、Piz-t,、Pi9等24個基因已被成功克隆，并開發出了特異性分子標記[4]。Pi-ta和Pib是最早分別從日本抗性材料BL-1、Tetep中克隆的抗稻瘟病基因，王忠華等利用抗稻瘟病基因Pita自身序列分別設計出能擴增抗病等位基因Pita的特異性引物YL155/YL87，和感病等位基因Pita的特異性引物YL183/YL87[5-6]。Pi-b基因位于水稻第2 染色體長臂近末端區域，Robert等利用抗稻瘟病基因Pib自身序列設計出能擴增抗病等位基因Pib的特異性引物Pibdom[7]。劉洋等利用抗稻瘟病基因Pib自身序列設計出能擴增感病等位基因Pib的特異性引物Lys145[8]。Pi-9是已克隆的抗譜最廣的基因，也是一個具有NBS-LRR 結構的抗性基因，它與Pi-2、Pi-zt、Pi-gm是復等位基因，同Pi-2和Pi-zt僅有8個氨基酸的差異，并找到了與該基因緊密連鎖的分子標記PB8[9]。戴小軍等利用抗稻瘟病基因Pi-9自身序列設計特異性顯性標記PB8[10]。華麗霞等通過序列比對，開發出Pi-zt特異性顯性分子標記Pizt-PA[11]。利用這些標記可以快速準確地從水稻資源中鑒定并篩選含有抗性基因Pita、Pib、Pi-9和Pi-zt的材料。【本研究切入點】本研究利用Pita、Pib、Pi-9和Pi-zt基因的特異性分子標記對漢中地區73份材料進行抗瘟基因型檢測，鑒定其抗性基因型背景，初步建立抗性基因數據庫，減少抗病育種的盲目性，提高育種效率。【擬解決的關鍵問題】為抗稻瘟病基因分子輔助聚合育種提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

漢中市農業科學研究所現存和外引的73份水稻材料，材料的名稱和類型見表2。

1.2 菌株來源及接種調查

室內抗譜選用的菌株均采自自住栽培品種，主要來源于漢中高發稻瘟病區域。根據最近幾年稻瘟病菌生理小種的致病性測定情況選出的代表性菌株，所有菌株均保存于漢中市農業科學研究所植保室。菌株的培養、活化、繁殖均按照常規方法，選取濃度適中的孢子懸浮液進行人工噴霧接種，接種1周后進行調查。病級調查按照國際水稻所稻瘟病圃苗瘟分級標準進行，0～3級為抗，4～9級為感。

1.3 水稻基因組DNA提取和PCR擴增

采集分蘗盛期的試驗材料葉片，用CTAB法提取全基因組DNA。PCR擴增體系為20 μl：2 μl 10× buffer，2 μl DNA，2 μl dNTP，1 μl正反引物，0.5 μl MgCl2，0.5 μlTaq酶，11 μl蒸餾水，PCR反應條件為：94 ℃預變性4 min，94 ℃ 45 s，52 ℃ 1 min，72 ℃45 s，擴增重復34次，72 ℃延伸1 min。PCR產物用1.5 %瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，紫外燈下觀察和檢測。為保證實驗的可靠性，每個DNA 樣品重復3次。

1.4 引物選擇

利用Pi-ta基因特異性分子標記YL155/YL187對供試材料進行檢測，以能擴增出1042 bp目標片段的為含有Pi-ta基因；利用Pi-9基因特異性分子標記PB8對供試材料進行檢測，以能擴增出500 bp目標片段的為含有Pi-9基因；利用Pi-b基因特異性分子標記Pi-bdomF/Pi-bdomR對供試材料進行檢測，以能擴增出365 bp目標片段的為含有Pi-b基因；利用Pi-zt基因特異性分子標記對供試材料進行檢測，以能擴增出176 bp目標片段的為含有Pi-zt基因。用于PCR擴增反應的引物名稱、序列和擴增片段預期大小(表1)。

2 結果與分析

2.1 4個稻瘟病抗性基因分子鑒定及其分布

圖1～4分別為抗性基因Pi-ta、Pi-9、Pi-b和Pi-zt在部分材料中的檢測結果，表2為73份材料的檢測結果。由表2可以看出，73份材料中有3個材料含有Pi-ta基因；10個材料含有Pi-9基因；13個材料含有Pi-b基因；72個材料含有Pi-zt基因。從表2還可以發現，73份供試材料中54個含有1個基因，13個含有2個基因，6個含有3個基因，未見含有4個基因的材料。

在檢測的材料中，抗性基因Pi-zt的頻率最高，檢出率為98.6 %，其次為抗性基因Pi-b和Pi-9，檢出率分別為17.8 %和13.7 %，檢出頻率最低的是Pi-ta，為4.1 %。

2.2 檢測的抗稻瘟病基因數量、類型與抗病相關性分析

對4個抗性基因在73份水稻材料中的分布與抗性分析表明，73份材料中含3個基因的有6個，其中5個表現為抗性水平(Pi-9+Pi-b+Pi-zt)，1個表現為感性(Pi-ta+Pi-b+Pi-zt)；含2個基因的有13個，含Pi-b+Pi-zt有6個，5個表現為感性水平，1個表現為抗性水平(360A)，含Pi-9+Pi-zt有5個，4個表現為感性水平，1個表現為抗性水平(R669),含Pi-ta+Pi-zt有2個，均表現為感性水平，表明這幾個基因聚合在一起抗性比較弱。含有1個基因的有54個，53個含有Pi-zt，1個含有Pi-b，54個中17個表現為抗性水平，16個含有Pi-zt的表現為抗性，1個含有Pi-b表現為抗性，這并不意味著2個基因的抗性水平高，應該是還攜帶著其他的抗性基因。

表1 用于PCR反應的引物名稱、序列和擴增片段預期大小

M: DL2000 marker; 1: R126; 2: R150; 3: IR24; 4: 成恢727; 5: R150; 6: 成恢177; 7: IR24; 8: R563; 9: R225; 10: R115; 11: 宜恢1108; 12: R263; 13: R1025; 14: R1026; 15: 2208B; 16: R675; 17: R676; 18: R491; 19: R138; 20: R182M: DL2000 marker; 1: R126; 2: R150; 3: IR24; 4: Chenhui727; 5: R150; 6: Chenhui177; 7: IR24; 8: R563; 9: R225; 10: R115; 11: Yihui1108; 12: R263; 13: R1025; 14: R1026; 15: 2208B; 16: R675; 17: R676; 18: R491; 19: R138; 20: R182圖1 部分材料Pi-ta基因的擴增Fig.1 PCR results of gene Pi-ta in some materials

M: DL100 marker; 1: 318A; 2: Y58S; 3: 909S; 4: 川106A; 5: 360A; 6: 理想S; 7: 川浙A; 8: 327B; 9: 泰豐A; 10: R146; 11: R387; 12: 蜀恢527; 13: R25; 14: 恩恢85; 15: 蜀恢527; 16: IR26; 17: 多絲一號; 18: IR26; 19: R669; 20: R208M: DL100 marker; 1: 318A; 2: Y58S; 3: 909S; 4: 川106A; 5: 360A; 6: LixiangS; 7: ChuanzheA; 8: 327B; 9: TaifengA; 10: R146; 11: R387; 12: Shuhui527; 13: R25; 14: Enhui85; 15: Shuhui527; 16: IR26; 17:Duosiyihao; 18: IR26; 19: R669; 20: R208圖2 部分材料Pi-9基因的擴增Fig.2 PCR results of gene Pi-9 in some materials

M: DL100 marker; 1: R126; 2: R150; 3: IR24; 4: 成恢727; 5: R150; 6: 成恢177; 7: IR24; 8: R563; 9: R225; 10: R115; 11: 宜恢1108; 12: R263; 13: R1025; 14: R1026; 15: 2208B; 16: R675; 17: R676; 18: R491; 19: R138; 20: R182M: DL100 marker; 1: R126; 2: R150; 3: IR24; 4: Chenhui727; 5: R150; 6: Chenhui177; 7: IR24; 8: R563; 9: R225; 10: R115; 11: Yihui1108; 12: R263; 13: R1025; 14: R1026; 15: 2208B; 16: R675; 17: R676; 18: R491; 19: R138; 20: R182圖3 部分材料Pi-b基因的擴增Fig.3 PCR results of gene Pi-b in some materials

M: DL100 marker; 1: 768-5B; 2: 2020-1B; 3: 2020-2B; 4: 2020-3B; 5: 2020-4B; 6: 素92B; 7: 中嘉B; 8: 中88B; 9: 28早-1B; 10: 28早-2B; 11: 青56B; 12: 2122B; 13: N23B; 14: 2150B; 15: 278B; 16: 279B; 17: 279-1B; 18: 川浙B; 19: 279-2B; 20: 283BM: DL100 marker; 1: 768-5B; 2: 2020-1B; 3: 2020-2B; 4: 2020-3B; 5: 2020-4B; 6: Su92B; 7: ZhongjiaB; 8: Zhong88B; 9: 28Zao-1B; 10: 28Zao-2B; 11: Qing56B; 12: 2122B; 13: N23B; 14: 2150B; 15: 278B; 16: 279B; 17: 279-1B; 18: ChuanzheB; 19: 279-2B; 20: 283B圖4 部分材料Pi-zt基因的擴增 Fig.4 PCR results of gene Pi-zt in some materials

通過進一步分析在含Pi-ta、Pi-9、Pi-b和Pi-zt等不同的抗性基因對提升水稻抗性頻率的貢獻，結果顯示，不同的抗性基因對提升水稻抗性的貢獻不同，其中，攜帶Pi-b基因的材料中，表現為抗性材料的頻率為61.5 %；攜帶Pi-9基因的材料中，表現為抗性材料的頻率為60 %；攜帶Pi-zt基因的材料中，表現為抗性材料的頻率為34.7 %。結果表明，Pi-b和Pi-9在漢中地區表現出較好的抗瘟性，對該地區的抗瘟性貢獻較大。尤其是同時含有Pi-9、Pi-b和Pi-zt3個基因的材料中，抗病率百分之百，表明3個基因聚合在一起，能夠表現出較好的抗性。

表2 供試材料分子標記檢測結果和抗性反應

續表2 Continued table 2

序號 Code材料名稱Name of materialPi-taPi-9Pi-bPi-zt合計Total抗感性Reactions39909S---+1S40川106A--++2S41360A--++2R42理想S---+1S43川浙A-+-+2S44327B--++2S45泰豐A-+++3R46R146---+1R47R387---+1R48R25---+1S49恩恢85---+1R50蜀恢527+--+2S51IR26---+1R52多絲一號---+1R53R669-+-+2R54R208---+1R55R126--+-1R56R150---+1S57成恢727---+1R58R150+--+2S59成恢177+-++3S60IR24--++2S61R563---+1R62R225---+1R63R115---+1R64宜恢1108---+1S65R263-+++3R66R1025-+++3R67R1026-+++3R682208B---+1S69R675---+1R70R676---+1R71R491---+1R72R138---+1R73R182---+1R合計Total3101372

注：“+”含該基因；“-”不含該基因；R：抗病； S：感病。

Notes: ‘+’indicated that the gene were contained; ‘-’ indicated that the gene were not contained; R: Resistant; S: Susceptible.

3 討 論

由于稻瘟病病菌具有耐藥性、易變異等特點，因此，同一稻區和不同稻區的稻瘟病菌有所不同，品種的抗病性往往表現出巨大差異，導致單一抗性品種不能夠長效的保持抗性。實踐證明，培育抗性品種是防治稻瘟病最經濟、有效的方法。傳統的抗性育種主要依賴于表現型的特點，而表現型容易受環境以及人為因素的干擾，從而降低了選育結果的可靠性及抗病育種效率。而分子標記輔助選擇技術不受外部環境的影響，分析手段快速簡便，即保證了結果的可靠性，又能提高育種效率。因此，通過傳統育種方法結合分子標記輔助選擇技術是進行抗病育種的有效手段。劉仕平等[12]研究表明，多個抗性基因的聚合后，并不簡單的是單個抗病基因的抗譜之間的簡單累加，而是抗性基因之間表現為極顯著的基因互作，從而促使抗譜拓寬，抗性增強，使其能夠抵抗單個抗病基因不能抵抗的生理小種。一個材料中含有的抗病基因數量越多，其抗性材料的出現頻率可以得到相應提升，但是也不盡然，還需要看含有的抗性基因是否有顯著的基因互作。為了減少基因聚合的盲目性，增加目的性和可靠性，通過分子標記了解水稻材料中的抗性基因背景。如李進斌[13]等和劉華招[14]等利用pita和pib抗性基因分子標記分別對云南種植稻種和黑龍江種植稻種中2個基因的分布進行了鑒定分析。時克等[15]利用分子標記檢測了58個水稻品種的Pita和Pib基因的分布狀況。何重等[16]利用Pi-ta和Pi-b基因標記，對江蘇地區粳稻品種進行了基因檢測，明確了抗性基因Pi-ta和Pi-b在江蘇粳稻品種中的分布，且Pi-b的分布頻率較高。張羽[17]等通過分子標記檢測了陜西省水稻種質資源中Pi-9基因的分布狀況，并指出陜西省主要水稻種質資源中Pi-9基因所占比例較少。戴小軍等對70 個水稻稻瘟病感抗病品種進行了Pi-ta、Pi-b、Pi-9 以及Pi-km 基因檢測，初步建立了抗性基因數據庫。

4 結 論

本研究對漢中地區73份水稻材料進行了Pi-ta、Pi-9、Pi-b和Pi-zt基因檢測，了解了4個基因的分布以及對抗稻瘟病的貢獻。通過4個基因的分布頻率以及貢獻率發現，供試材料中4個基因都有分布，分別檢測到有含3個基因，2個基因以及1個基因的材料，其中Pi-zt的分布頻率最高，且大部分材料只含有這1個基因，大部分表現感病，個別表現出抗病，表現抗病的材料應該是含有其他抗性基因，而Pi-zt基因在抗病圃里應該是減弱或已喪失抗性。Pi-9和Pi-b的分布頻率和貢獻率差不多，在基因聚合中，Pi-b+Pi-zt有6個，5個表現為感性水平，1個表現為抗性水平，含Pi-9+Pi-zt有5個，4個表現為感性水平，1個表現為抗性水平，含Pi-ta+Pi-zt有2個，均表現為感性水平。而同時含有Pi-9、Pi-b和Pi-zt的材料均表現為抗性。由于Pi-zt普遍存在，同時聚合Pi-9和Pi-b是提升材料抗性的一種手段。通過本研究，初步建立了抗性基因數據庫，為聚合多基因提升水稻抗性提供依據。本實驗所選材料和抗性基因較少，不能解決所隱藏的問題，如只含Pi-zt基因所表現抗性的材料，其還含有哪些基因來提升抗性；聚合3個或多個基因的材料抗性是否強于1個或2個基因的材料抗性等。下一步將繼續擴大群體和基因數量，進一步完善漢中地區抗性基因數據庫，為水稻抗病育種提供資源。