近紅外熒光傳感法測定中藥材中赭曲霉毒素A

曾云龍， 趙 敏， 張 敏， 易守軍， 唐春然， 夏曉東, 賀超才

(1. 湖南科技大學 化學化工學院， 理論有機和功能分子教育部重點實驗室， 湖南 湘潭 411201;2. 長沙職業技術學院， 湖南 長沙 410217)

1 引 言

植物的植株、種子和莖塊通常是中藥材的主要組成部分，是中醫治療疾病的物質基礎。然而植物中藥材在生長、收獲、運輸、貯存等環節中極易受到霉菌污染[1-2]，藥材受到赭曲霉、純綠青霉和碳黑曲霉污染后，它們的代謝產物中存在高毒性赭曲霉毒素A(OTA)，致使中藥材中OTA污染普遍存在[3-7]。OTA具有致癌、致畸、致突變、腎毒性等毒性[8-9]。服用含有微量OTA的中藥，一般不會致病患者出現急性中毒現象，但它能在人體內積蓄，對人造成慢性毒害，引發各種疾病。近年來，人們發現中藥對一些重大疾病和慢性病的療效較西藥更為顯著，且毒副作用較西藥低，因此，歐美等發達國家開始研究和使用中藥。但中藥(材)普遍受到真菌毒素污染，由此引發的安全性已受到國內外的高度重視，歐盟規定辣椒、肉豆蔻、干姜、姜黃及其混合物中OTA的限量為15 μg·kg-1，甘草根的浸漬物中OTA 限量為20 μg·kg-1。我國是中草藥的發源地，目前大約有12 000種藥用植物，為了確保藥用安全并加速中藥國際化和現代化，對中藥材中OTA進行監測具有重要意義。

目前，中藥材中痕量OTA檢測方法主要有色譜法和酶聯免疫法[10-12]等。酶聯免疫法存在抗原/抗體和酶的價格高、且易失活而失效的問題；色譜法及色-質聯用法技術要求高、所需試劑純度高、儀器設備昂貴、分析成本高，不易普及。因此，非常有必要發展簡單、快速、靈敏、準確的中藥材真菌毒素檢測方法。碳量子點碳源豐富，制備方法簡單、環保，具有很好的光學特性和生物相容性，廣泛應用于活體成像、醫療診斷和化學生物傳感等領域[13-15]。通常碳量子點熒光發射在400～550 nm可見光范圍，以其作為探針，易受內源性物質熒光的干擾，如果以近紅外熒光量子點為探針則能有效地消除內源性物質熒光的干擾。核酸適體具有選擇性高、穩定性好、價格低等優勢，已廣泛應用于生命科學、環境監測、疾病診斷和食品安全監測分析[16-18]；然而，核酸適體用于檢測中藥材中痕量OTA的報道較少。本文利用核酸適體高選擇性、近紅外熒光碳量子點優異的熒光特性，建立了簡單、快速、靈敏的中藥材中痕量OTA的生物傳感檢測新方法。

2 實 驗

2.1 主要試劑與儀器

巰基修飾的OTA核酸適體核酸(Apt)序列[16,19]:HS-AAAAAAGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B(OTB)、黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、伏馬毒素B1(FB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等真菌毒素均由北京華安麥科生物技術有限公司提供；氯金酸、檸檬酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP) 等購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；考馬斯亮藍、葡萄糖和乙二胺等購自國藥試劑有限公司；其他試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

熒光測定在RF-5301PC熒光分光光度計(日本島津公司)上進行。

2.2 實驗方法

2.2.1 近紅外熒光碳量子點的制備

近紅外熒光碳量子點(NIRF-CQDs)按文獻[20] 方法并進行適當改進合成。簡言之，先將3%的葡萄糖水溶液置于200 ℃的水熱反應釜的恒溫鼓風干燥箱中加熱反應4 h，取出自然冷卻至室溫，過濾、離心除去大顆粒，制得最大熒光發射峰位于440 nm 左右的碳量子點預備溶液。取制備的碳量子點預備溶液2 mL, 加入1%考馬斯亮藍溶液5 mL、1%乙二胺溶液2 mL，超聲5 min，加入40 mL 水，轉至水熱反應釜中，在200 ℃下反應4 h，取出自然冷卻至室溫，10 000 r·min-1離心10 min，過濾，然后在經透析洗滌后，將透析袋中溶液旋轉蒸干，即得到熒光發射為744 nm的近紅外碳量子點，置于陰涼處備用。

2.2.2 金納米粒子的制備

金納米粒子(AuNPs)按文獻[21]方法以檸檬酸鈉還原氯金酸制備，即：取250 mL 0.1 mmol·L-1HAuCl4溶液置于潔凈的燒杯中，在劇烈攪拌下加熱至沸騰，然后迅速加入5 mL 38.8 mmol·L-1檸檬酸鈉，溶液顏色由淺黃變為酒紅色，繼續反應30 min后冷卻至室溫。AuNPs 的濃度按文獻[22]方法測定為2.7 nmol·L-1。

2.2.3 金納米粒子表面修飾核酸適體

巰基修飾的核酸適體在金納米粒子進行表面自組裝按文獻[23]方法進行。取巰基修飾的Apt與TCEP(Apt∶TCEP=1∶5)混勻反應1 h，即得活化的Apt；然后將活化的Apt與2.7 nmol·L-1AuNPs 混合，加入500 mmol·L-1酒石酸-HCl 緩沖溶液(pH=3.0)，在室溫下孵化30 min，轉至10 000 r·min-1離心25 min 除去未修飾到金納米粒子表面的Apt，再用pH=7.3的10 mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗，如此3次，得到Apt修飾的金納米粒子(AuNPs/Apt)，將其分散于水中，4 ℃下儲存備用。

2.2.4 AuNPs/Apt/NIRF-CQDs復合物的制備

將NIRF-CQDs與AuNPs/Apt在10 mmol·L-1pH=7.3 的PBS溶液中混合均勻，靜置反應10 min，離心去除過量的NIRF-CQDs，沉淀再用二次蒸餾水洗滌，再離心，如此3次，得到AuNPs/Apt/NIRF-CQDs復合物，備用。

2.2.5 OTA測定

先將AuNPs/Apt/NIRF-CQDs復合物超聲分散至水中，測定其熒光強度；然后，向分散液中加入不同濃度的OTA(0～2.40 ng·mL-1)，混勻反應5 min，測定溶液的熒光強度。按同樣的方法，向復合物分散液中加入其他真菌毒素(AFB1、AFB2、DON、FB1、OTB和ZEN)，進行傳感器的選擇性試驗，OTA的濃度為1.0 ng·mL-1，其他真菌毒素的濃度均為10 ng·mmol-1，以615 nm為激發波長，測定熒光發射光譜(最大發射波長為744 nm)強度。光譜測定都在室溫下10 mmol·L-1PBS(pH=7.3)中進行。所得數據均為3次測定平均值。

2.2.6 中藥材中OTA測定

中藥樣品經研碎，過三號篩，稱取其粉末 5 g，加入70%甲醇溶液 50 mL，超聲30 min,以4 000 r·min-1離心5 min,取上層清液10 mL，用水稀釋至 20 mL,搖勻,即得試樣溶液。

取試樣溶液適量置于AuNPs/Apt/NIRF-CQDs分散溶液中，混勻，再加入PBS緩沖溶液，搖勻，孵化5 min，測定溶液的熒光強度，確定中藥材中OTA含量。

3 結果與討論

3.1 碳量子點熒光特性

圖1是碳量子點的熒光發射光譜。所制備的碳量子點具有很好的近紅外熒光發射特性，激發波長位于615 nm時, 所制備的碳量子點的熒光發射最強，其發射峰位于744 nm。以所合成的近紅外熒光碳量子點為探針檢測OTA，可以很好地避開內源性物質在可見光區的熒光發射，因此能有效地消除內源性物質的干擾。

圖1 碳量子點的熒光光譜。a:激發光譜，b:發射光譜。

Fig.1 Fluorescence spectra of CQDs. a: Excitation spectrum. b: Emission spectra.

3.2 方法原理

金納米粒子具有強烈的熒光猝滅功能[24]。本工作以金納米粒子為熒光猝滅劑，以近紅外熒光碳量子點為熒光探針，構建OTA傳感監測平臺。先將巰基-OTA核酸適體與金納米粒子自組裝，形成AuNPs/Apt；再向AuNPs/Apt體系中加入NIRF-CQDs，通過靜電作用[25]，NIRF-CQDs與AuNPs/Apt自組裝生成AuNPs/Apt/NIRF-CQDs復合物，NIRF-CQDs熒光猝滅。向AuNPs/Apt/NIRF-CQDs復合物分散液體系中加入OTA時，Apt選擇性地與OTA反應生成Apt-OTA復合物，同時釋放出NIRF-CQDs，體系熒光恢復(如圖2所示)。根據OTA的濃度與體系的熒光恢復程度之間的關系，實現樣品中OTA的檢測。

圖2 金納米粒子/核酸適體/NIRF-CQDs+赭曲霉毒素A體系的熒光光譜

Fig.2 Fluorescence spectra of AuNPs/Aptamer/NIRF-CQDs+OTA

3.3 條件優化

3.3.1 核酸適體用量的影響

研究了AuNPs/Apt復合物中Apt與AuNPs的量比對NIRF-CQDs熒光猝滅和恢復的影響，其猝滅程度如圖3所示。圖3顯示，Apt為AuNPs的50～150倍時，NIRF-CQDs的熒光猝滅隨Apt的比例增大而迅速增強；達到175～225倍時，體系熒光強度基本穩定。185倍時，熒光猝滅達到最大值。

圖3 核酸適體與金納米粒子的量比對體系熒光猝滅的影響

Fig.3 Influence of aptamer and AuNPs in mole ratio on fluorescent quenching

向已發生熒光猝滅的體系中加入OTA樣品，體系熒光強度恢復情況與熒光猝滅的變化類似，與Apt的量有關。Apt用量較低時，熒光恢復程度隨Apt的用量增大而增大；Apt的用量為AuNPs的185倍時，體系熒光恢復程度達到最大，之后，熒光恢復測定Apt隨用量增大而降低。故在后續試驗中選擇Apt的用量為AuNPs的185倍(量的比)。

3.3.2 pH值對體系熒光強度恢復的影響

由于NIRF-CQDs表面氨基對H+離子敏感，在酸性環境中NIRF-CQDs接受質子，使熒光猝滅；同樣，在較高pH值(堿性)環境中，其表面氨基可以形成氫鍵，引起碳量子點的團聚，也使熒光猝滅。因此，研究了弱酸性至弱堿性范圍(pH=4.0～9.0)體系熒光強度變化，結果見圖4。從圖4可知，在pH=4.0～6.5時，體系熒光強度隨pH升高而呈線性增大，這是由于隨體系pH增大，碳量子點表面接受質子能力減弱所致；在pH=6.5～7.5范圍，體系熒光強度變化緩慢，且在pH=7.0～7.5時出現一穩定的最大值平臺；之后又呈線性減弱變化，這是碳量子點團聚所導致的熒光猝滅現象。在pH=7.0～7.5范圍內，體系熒光變化對pH不敏感，因此， pH控制在該范圍內，體系熒光強度有很好的重現性，并不受pH變化的影響，故在后續試驗中，控制體系pH=7.3。

圖4 pH對體系熒光強度恢復的影響

Fig.4 Influence of pH on fluorescence intensity recovery in the system

3.3.3 孵化時間的影響

研究顯示，復合物中Apt能迅速地與OTA結合并釋放出NIRF-CQDs。室溫環境中，當樣品與復合物混合，體系熒光強度迅速恢復，孵化5 min后，體系熒光強度不再增大，并在40 min 保持穩定。后續試驗中孵化時間定為5 min。

3.3.4 其他真菌毒素物的影響

圖5是OTA核酸適體傳感對OTA與其他真菌毒素的選擇性試驗。結果顯示，其他真菌毒素無干擾。因此，OTA核酸適體傳感可用于中藥材復雜體系中的OTA測定。

圖5 核酸適體傳感分析的選擇性，OTA為1.0 ng·mL-1，其余真菌毒素濃度為10 ng·mL-1。

Fig.5 Selectivity of the aptasensor assay, concentration of OTA: 1.0 ng·mL-1, others: 10.0 ng·mL-1.

3.3.5 標準曲線和檢出限

取AuNPs/Apt/NIRF-CQDs分散液0.1 mL用10 mmol·L-1PBS(pH=7.3)稀釋至2 mL，測定體系的熒光強度，記為F0；再分別依次向上述方法制備的溶液中加入不同濃度的OTA標準溶液，孵化5 min，測定體系熒光，記為F；其熒光強度差值為體系熒光恢復程度y=F-F0。試驗結果如圖6所示，體系的熒光強度隨著OTA的濃度增大而增強，并且，體系的熒光恢復程度y與OTA濃度在0.015～1.5 ng·mL-1范圍內呈現出良好的線性關系，其線性回歸方程為y=1.816+123.4C(C為OTA的濃度，單位：ng·mL-1)，相關系數R2=0.998 3，方法檢出限(3σ/k)為8 pg·mL-1。

圖6 體系的熒光強度隨OTA濃度(0,0.015,0.030,0.050,0.10,0.20,0.30,0.50,0.75,1.00,1.50 ng·mL-1)的變化情況。插圖：F-F0與OTA的濃度在0.015～1.5 ng·L-1范圍內成良好的線性關系。

Fig.6 Dependence of fluorescent intensity on the concentration of OTA(0, 0.015, 0.030, 0.050, 0.10, 0.20, 0.30, 0.50, 0.75, 1.00， 1.50 ng·mL-1). Inset shows the linear relationship between theF-F0and OTA concentration within the range of 0.015-1.50 ng·mL-1.

3.4 分析應用

將所構建的核酸適體傳感體系應用于中藥材樣品中的 OTA 檢測，結果如表1所示。

從表1 可知，所測樣品均不同程度地受到OTA污染，其中麥芽和甘草污染較為嚴重，表明麥芽和甘草易受OTA污染，應加強對它們的質量監控。另外，回收率和 RSD 的結果表明，該傳感體系適用于中藥材中殘留真菌毒素檢測。

表1 幾種中藥材樣品中 OTA的檢測

4 結 論

核酸適體、金納米粒子和NIRF-CQDs通過自組裝形成AuNPs/Apt/NIRF-CQDs核酸適體納米復合物，使復合物中近紅外熒光碳量子點的熒光猝滅，復合物中Apt與OTA特異性結合，釋放出NIRF-CQDs，使其熒光恢復，據此，建立了近紅外熒光測定OTA的新方法；而以近紅外熒光量子點為探針能有效地消除內源性物質的干擾，提高了檢測的選擇性。對連翹、麥芽、甘草等中藥材中的OTA進行測定，顯示麥芽、甘草受OTA污染較為嚴重。該方法在實際樣品分析中的回收率在96.8%～104.2%，相對標準差小于5%，能滿足中藥材中微量OTA的檢測要求。