HBV 感染人外周血單個核細胞時體外免疫效應的變化

梅清 李小鵬 吳振平 李丹 張文苑 余婷婷 張倫理

南昌大學第一附屬醫院感染科（南昌330006）

據世界衛生組織報道全球約20 億人曾感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），其中2.4 億人為慢性HBV 感染者。每年約有100 萬人死于HBV感染所致的肝功能衰竭、肝硬化和肝細胞癌［1］。慢性HBV 感染成為亟待解決的全球公共衛生問題。目前由于尚未完全闡明慢性HBV 感染形成的機制，所以很難實現HBV 的免疫清除。既往研究表明HBV 感染時，機體免疫系統激活，并產生一系列免疫效應，包括免疫細胞數改變、免疫細胞分泌的細胞因子的濃度變化如：干擾素-γ（interferonγ，IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），免疫細胞的細胞表面受體的陽性率發生改變：如程序性死亡受體-1（programmed death receptor-1，PD-1），而這些物質的含量皆與HBV 感染后的預后相關。外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）是由T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、自然殺傷細胞等多種免疫細胞組成的混合群體，在先天性免疫、適應性免疫中發揮著至關重要的作用［2］。近些年有大量文獻［3-5］報道HBV 能感染PBMCs，其臨床價值也正越來越引起重視。體外觀察PBMCs 感染HBV 后出現的一系列免疫效應變化，有益于理解HBV 感染在體內發生的機制，為進一步理解慢性HBV 感染形成的機制提供幫助。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 （1）細胞：PBMC 取自10 名健康志愿者的外周靜脈血（健康志愿者為近期體檢排除乙肝、丙肝、艾滋、腫瘤等疾病且乙肝五項全陰的志愿者）。（2）主要試劑：RPMI 1640 培養基購于美國Hyclone 公司、胎牛血清購于德國PAN 公司；人淋巴細胞分離液購于天津TBD 公司；重組人白細胞介素2（interleukin 2，IL-2）購于美國Proteintech 公司；細胞計數試劑盒（cell counting kit，CCK8）購于美國Sigma 公司；IFN-γ ELISA 和TNF-α ELISA 檢測試劑盒均購于武漢三鷹生物工程有限公司；使用的所有流式抗體均為北京達科為生物技術有限公司的Biolegend（USA）抗體，包括鼠抗人CD3-FITC、CD8-PE∕CY7、PD-1-PE 抗體和抗鼠IgGl-FITC、IgGl-PE∕CY7、IgGl-PE 同型對照抗體。

1.2 方法

1.2.1 提取和培養人PBMCs 取健康人外周靜脈血80 mL，采用Ficoll 法分離PBMC，并用完全培養基（含10%胎牛血清、IL-2 200 U∕mL）調節PBMC細胞濃度至1.0×106個∕mL，接種于6 孔板中，每孔2 mL。

1.2.2 HBV 持續刺激PBMCs 在門診收集HBV DNA 濃度為2×107IU∕mL 的免疫耐受期的HBV 感染者血清。實驗分兩組，分別為對照組（PBMCs）、實驗組（免疫耐受期的HBV感染者血清+PBMCs），每組設置重復孔4 孔。輕混培養液使其均勻后置入CO2孵箱中培養，前6 d 每隔1 d 對對照組、實驗組補充500 μL 的完全培養基，同時實驗組還每隔1 d 每孔補充25 μL 的慢性HBV 感染者的血清，在第8 天時進行離心換液，以后每隔1 d 進行1 次換液，同時實驗組每隔1 d 還需補充25 μL 患者血清，收集第0、2、4、6、8、12、18、24 天的實驗組和對照組的上清液。

1.2.3 CCK-8 檢測PBMC 增殖 參照說明書進行實驗。在0、2、4、6、8 d 時，將實驗組、對照組PBMC，重懸，取其中的100 μL 細胞懸液和空白組（完全培養基）100 μL 分別接種于96 孔板中，實驗中每組均設3 個復孔，結果以3 孔平均值計算。向每孔加入100 μL CCK-8 試劑，然后置入37 ℃CO2孵箱中繼續培養3 h，用酶標儀測定450 nm 波長時的吸光度。

1.2.4 ELISA 法檢測IFN-γ和TNF-α的濃度 采用ELISA 法檢測收集的（第0、2、4、6、8、12、18、24天）實驗組和對照組細胞培養上清液中IFN-γ和TNF-α的濃度，參照說明書進行實驗。根據酶標儀測定出的標準品的OD值繪畫出標準曲線，繼而再計算出IFN-γ和TNF-α的濃度。

1.2.5 流式細胞學檢測CD8+T 細胞上PD-1 陽性率 提取并收集未開始刺激時實驗組和對照組的PBMC，以及HBV 刺激24 d 時實驗組和對照組的PBMC，離心后，用PBS 洗滌，并再次用PBS 調整細胞懸液至100 μL，加入鼠抗人CD3-FITC、CD8-PE∕CY7 及PD-1-PE 抗體，于4 ℃避光溫育30 min，用PBS 洗滌2 次后在貝克曼FC500 流式儀上機，使用對應的同型對照組和裸細胞組進行對照。用CD3+CD8+雙陽性細胞群設門，標出CD3+CD8+PD-1+全陽性的百分比。數據使用CXP軟件進行分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19 進行數據分析。所有數據均以平均值±標準差表示，組間單變量比較使用獨立t檢驗進行比較。當P＜0.05 時，認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞的生長曲線 在培養的0、2、4、6、8 d 分別用CCK-8 試劑盒檢測PBMC 的增殖狀況。CCK8法檢測結果顯示經過患者血清刺激的PBMC 在前8 d 隨著時間的增加，數量逐漸增加，且在第8 天時實驗組數量明顯高于對照組（P＜0.05，圖1）。

圖1 PBMC 培養生長曲線Fig.1 Growth curve of PBMC culture

2.2 上清液炎癥因子的檢測 未開始刺激（即HBV 刺激的第0 天）時，IFN-γ 和TNF-α 分泌水平均低于檢測值下限。在刺激的第8天實驗組TNF-α濃 度（1 646.89±149.92）pg∕mL 高于對照組［（1 061.20±151.29）pg∕mL，t= 4.76，P= 0.009，圖2］。刺激的第24 天時，實驗組TNF-α 濃度（395.67 ±25.17）pg∕mL 低于對照組［（576.33±15.18）pg∕mL，t=-10.65，P= 0.000，圖2］。在刺激的第8 天，實驗組IFN-γ 的濃度（134.00±15.10）pg∕mL 高于對照組［（24.26±8.22）pg∕mL，t= 11.06，P= 0.000，圖3］。在刺激的第24 天，實驗組IFN-γ 的濃度（14.05± 1.65）pg∕mL 低于對照組［（20.75±2.47）pg∕mL，t=-3.91，P=0.017，圖3］。

圖2 各組隨著培養天數的改變上清液中TNF-α 的濃度Fig.2 The concentration of TNF-α in the supernatant of each group changed with the number of culture days

圖3 各組隨著培養天數的改變上清液中IFN-γ 的濃度Fig.3 The concentration of IFN-γ in the supernatant of each group changed with the number of culture days

2.3 CD8+T 細胞上PD-1 的陽性率 未開始刺激時，實驗組和對照組CD8+T 細胞上PD-1 陽性率均為（12.23±1.72）%，病毒持續刺激24 d 后，實驗組PD-1 表達水平與對照組PD-1 表達水平分別為（16.70±1.65）%、（13.17±2.31）%。實驗組刺激24 d后（圖4、5）與未開始刺激時（圖6、7）相比，PD-1 表達水平升高，差異有統計學意義（P= 0.032）；對照組PD-1 表達水平第24 天（圖8、9）與未開始刺激時（圖6、7）相比（P=0.605），差異無統計學意義。

3 討論

全球約有1∕3 的人口都感染過HBV，但不同時期感染出現的結局很可能會不同。嬰幼兒期感染HBV 易發展為慢性肝炎，而成年期感染的則只有不到5%的為慢性乙型肝炎，大多數為急性肝炎。目前，HBV 感染慢性化的具體機制仍尚未闡明［6］，慢性乙型肝炎也因此無法實現根治。既往研究［7-8］指出HBV 感染的發病機制主要是免疫介導的，所以相關的免疫效應的研究將可能有利于開辟治療乙肝的新途徑。本次實驗通過在體外用免疫耐受期HBV 感染者血清刺激健康人PBMCs 后發現，PBMCs 細胞群在受到HBV 刺激后初期部分免疫細胞能增殖，并且產生炎癥因子IFN-γ和TNF-α。但長期刺激后其炎癥因子產生能力減弱，且CD8+T細胞表面抑制性受體PD-1 表達上調。

圖4 刺激24 d 時的實驗組CD3+CD8+細胞群Fig.4 The cell population of CD3+ CD8+ in the experimental group at 24 days of stimulation

圖5 刺激24 d 時的實驗組CD8+T 細胞上PD-1 陽性率Fig.5 The positive rate of PD-1 on CD8+ T cells in the experimental group stimulated at 24 days of stimulation

圖6未開始刺激時CD3+CD8+細胞群Fig.6 The cell population of CD3+ CD8+ without stimulation

圖7 未開始刺激時CD8+ T 細胞上PD-1 陽性率Fig.7 The positive rate of PD-1 on CD8+ T cells without stimulation

圖8 第24天時的對照組CD3+ CD8+細胞群Fig.8 The cell population of CD3+ CD8+ in the control group on day 24

圖9 第24天時的對照組CD8+T 細胞上PD-1 陽性率Fig.9 The positive rate of PD-1 on CD8+T cells in the control group on day 24

HBV 感染引起的應答是由PBMCs 中多種免疫細胞和分泌的相關細胞因子共同參與。當HBV 感染時，乙型肝炎病毒核心抗原、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎病毒e 抗原皆能激活免疫系統［4-5］，繼而免疫細胞增殖，并大量分泌IFN-γ 和TNF-α。IFN-γ和TNF-α這兩種細胞因子能增強PBMCs 中多種免疫活性細胞的功能，包括抗原的識別、呈遞和吞噬等功能。既往研究［9-10］還指出形成特異性免疫的時間是1～2 周。本次實驗用免疫耐受期的HBV 感染者血清刺激PBMCs 時，在第8 天時PBMC大量增殖，實驗組IFN-γ和TNF-α均明顯高于正常組。這說明在8 d 時免疫系統可能被激活。近年來有文獻報道［11-12］HBV 感染時，IFN-γ和TNF-α這兩種細胞因子可能是通過降解病毒轉錄和復制模板、干擾HBV 共價閉合環狀DNA（HBV covalently closed circular DNA，HBV cccDNA）的完整性和穩定性，繼而降低了HBV 的水平，是抑制HBV 復制的關鍵。當病毒持續刺激時，本研究顯示在第24天時實驗組IFN-γ和TNF-α均明顯低于正常組，表明免疫細胞分泌細胞因子減少，清除病毒功能可能會降低。這與既往研究結果一致：當高病毒載量的HBV 持續存在時，Th1 類細胞因子產生減少，如IFN-γ和TNF-α等細胞因子減少，免疫應答也會減弱［10，12-13］。這也可能是免疫耐受期的HBV 感染者體內有大量HBV，但肝臟不會發生損傷，同時機體也不能清除HBV 的原因。

CD8+T 細胞是有助于清除HBV 的主要免疫細胞，而細胞表面上免疫抑制分子的陽性率與慢性肝炎的發生可能存在相關性［14］。鑒于此，近年來關于CD8+T 細胞上免疫抑制分子的研究越來越多［15-16］。在所有的抑制性受體中關于PD-1 的研究最多。本次研究比較了PBMCs 在受到HBV 持續刺激并出現弱的免疫應答時的CD8+T 細胞的陽性率和未開始刺激時的陽性率，結果表明受到病毒持續刺激的PD-1 陽性率明顯升高，這說明慢性HBV 感染者血清的持續刺激會上調HBV 特異性CD8+T 細胞上PD-1 的表達，與先前的研究結果相同［17］。有研究提出PD-1 的陽性率上升的原因可能是由于長期抗原刺激將導致CD8+T 細胞中PD-1啟動子的去甲基化，進而造成CD8+T 細胞中PD-1的上調［18］。近期有研究指出PD-1 和PD-L1 之間的相互作用會通過誘導T 細胞凋亡或T 細胞功能障礙導致肝臟免疫耐受［15］。因此，持續感染將導致CD8+T 細胞上PD-1 的陽性率的增加，繼而可能導致肝臟免疫耐受、乙肝的慢性化。

既往的體內研究對HBV 發病機制的理解做出了重大貢獻，但動物與人類免疫系統的不同導致動物與人在HBV 感染時產生免疫反應的差異，這造成對HBV 感染時機體產生的免疫應答理解的不足［19］。而既往針對HBV 發病機制的體外研究甚少，因此仍需要開展大量的相關研究。本次實驗利用免疫耐受期的HBV 感染者血清刺激正常人PBMCs 來研究相關的免疫效應，一方面避免了HBV 感染者血清中IFN-γ、TNF-α等炎癥因子對本實驗的干擾，另一方面也模擬了人體感染HBV 時的微環境，這些皆使得對HBV 感染過程中免疫應答的研究更加具有應用價值。然而本次研究仍存在一定的缺陷：HBV 引起的免疫應答是由多種免疫細胞和細胞因子共同參與，本研究只觀察了HBV 感染時IFN-γ、TNF-α濃度變化，白細胞介素-4、白細胞介素-10 等與乙肝感染有關的細胞因子則未進行研究；CD8+T 細胞上PD-1 的陽性率也只研究了未開始刺激時和刺激24 d 后的陽性率，未研究中間的變化過程。但此次實驗依然可反映持續感染與部分炎癥因子和CD8+T 細胞上PD-1 陽性率的關系。

既往研究表明HBV 感染時引起的免疫反應可以抑制HBV 復制或以非細胞溶解方式清除HBV［20］。因此，HBV 感染時機體免疫效應的研究將有利于尋找抑制HBV 復制的新方法，甚至將有助于實現世界衛生組織制定的到2030年根治乙型肝炎的目標［21］。