高尿酸對腎小管上皮細胞HK-2增殖、凋亡的影響及其機制研究

曾宇鵬 謝席勝

1閬中市人民醫院腎內科（四川閬中637400）；2南充市中心醫院腎內科（四川南充637000）

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）近年來發病率逐漸升高，嚴重威脅人們生命健康。CKD 具有患病率高、合并心血管疾病率高和病死率高的“三高”特點，以及知曉率低、防治率低和合并心血管疾病認知率低的“三低”特點［1］。我國CKD 總患病率達10.8%，CKD 患者預計近1.2 億，但CKD 知曉率僅為12.5%，CKD 患者最終進展為終末期腎病（end-stage renal disease，ESRD），患者需終生透析治療或者腎替代治療。腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是導致CKD 進展為ESRD 的主要病理改變。正常情況下，腎小管上皮細胞通過自身增殖、再生等機制自我修復腎小管損傷，并能夠通過凋亡機制清除自身老化、壞死細胞，維持腎小管正常生理功能。然而病理條件下，腎小管上皮細胞過度凋亡損傷腎組織結構和正常功能，是導致RIF 進展的重要機制之一。

尿酸（uric acid，UA）是嘌呤代謝的終末產物，嘌呤代謝紊亂、能量代謝異常及腎臟對尿酸的排泄障礙均可引起血漿尿酸濃度升高或降低。腎臟是尿酸代謝的主要器官，體內尿酸70%由腎臟排泄［3］。既往研究發現高尿酸通過線粒體途徑導致人腎小管上皮細胞（human renal tubular epithelial cells，HK-2）凋亡，高尿酸血癥是導致CKD 進展的重要因素［4］，此外高尿酸通過內質網應激調節HK-2 細胞表型轉化［5］，本研究重點探討尿酸抑制腎小管上皮細胞增殖并促進其凋亡，尿酸激活內質網應激可能是其重要分子機制，為治療高尿酸腎損害提供了新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎小管上皮細胞HK-2 購買自美國ATCC 細胞庫；DMED 培養基購自美國Gibco 公司，胎牛血清購自美國Hyclone 公司；尿酸和四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自美國Sigma-Aldrich 公司；4-苯基丁酸（4-PBA）購自美國Sigma-Aldrich 公司；Annexin V-FITC∕碘化丙啶雙標記細胞凋亡檢測試劑盒購自北京華夏遠洋科技有限公司；兔抗人Caspase-3∕Cleaved-Caspase-3、Caspase-12∕Cleaved-Caspase-12、BiP∕GRP78 抗體購自美國CST 公司；兔抗人IRE-1 和JNK 單克隆抗體購自美國abcam 公司；β-ACTIN抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.2 細胞培養 人腎小管上皮細胞HK-2 接種于含10%胎牛血清和雙抗溶液（青霉素100 IU∕mL 和鏈霉素100 IU∕mL）的DMEM 培養基中，細胞呈貼壁生長，放置在37 ℃、含5%CO2培養箱中進行常規培養，每隔2～3 d 細胞換液。當細胞生長至對數期時，用0.05%胰酶消化離心并重懸細胞，傳代于新培養皿繼續培養。

1.3 四甲基偶氮唑藍（MTT）實驗檢測細胞增殖將對數生長期的HK-2 細胞按照5 000 個∕孔接種于96 孔板，每組設置5 個復孔，37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱培養。待細胞貼壁后，分別加入0、50、100、150、200、250、300 mg∕L 的尿酸處理腎小管上皮細胞24 h，以及150 mg∕L 的尿酸處理腎小管上皮細胞24、48、72 h，處理后每孔加入含MTT 培養基200 μL，培養箱繼續孵育4 h。吸去培養基，每孔加入150 μL DMSO，振蕩器低速振蕩10 min。待結晶物充分溶解，使用酶標儀490 nm 處檢測各孔吸光度（OD值）。

1.4 免疫印跡法（Western blot）檢測蛋白水平 將HK-2 細胞消化離心后種于6 孔板內，待細胞貼壁后，加入不同濃度的尿酸分組繼續培養24 h。PBS清洗細胞3 遍，使用RIPA 裂解液裂解，提取總蛋白。采用BCA 法測定蛋白濃度，其余蛋白加入6×Loading buffer 加熱變性。取變性后蛋白20 μg ∕孔加入SDS-PAGE 凝膠電泳分離，110 V 電壓轉移至NC膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗3次，每次10 min。加特定一抗4 ℃孵育過夜。次日TBST 清洗10 min × 3 次，加入辣根過氧化酶標記的相應二抗，于搖床上慢速常溫孵育1 h，TBST清洗10 min× 3 次，加入ECL 顯影液，使用化學發光熒光成像系統（Bio-Rad）進行蛋白顯影。以β-actin 作為內參計算各組蛋白的相對表達量。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 HK-2 細胞常規培養，調整細胞密度按4.0 × 105∕孔接種于6孔板中，細胞培養至貼壁，加入150 和200 mg∕L 的尿酸分別處理HK-2 細胞24 h。PBS 清洗細胞后加入胰酶消化離心，再次使用PBS 清洗2 次，每管加入250 μL 結合緩沖液，細胞計數后調節細胞濃度為1.0 × 106∕mL，吸取100 μL 細胞懸液加入流式管，加入Annexin V-FITC（150 mg∕L）和碘化丙錠（120 mg∕L）混勻，放置于避光、室溫條件下孵育15 min，加入PBS清洗細胞，使用流式細胞儀（FACS）檢測細胞凋亡。

1.6 統計學方法 實驗結果使用SPSS 19.0 統計軟件進行分析，所得的實驗數據以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 尿酸抑制腎小管上皮細胞增殖能力 使用0、50、100、150、200、250、300 mg∕L 的尿酸處理腎小管上皮細胞24 h（圖1A），以及150 mg∕L 的尿酸處理腎小管上皮細胞24、48、72 h（圖1B），使用MTT 實驗檢測腎小管上皮細胞增殖能力的變化，結果顯示與對照組相比尿酸抑制腎小管上皮細胞增殖能力，并呈濃度依賴性和時間依賴性，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 尿酸促進Cleaved-Caspase-3 和Cleaved-Caspase-12 蛋白表達 實驗組150 和200 mg∕L 濃度尿酸處理腎小管上皮細胞24 h，通過Western blot檢 測Caspase-3∕Cleaved-Caspase-3 和Caspase-12∕Cleaved-Caspase-12 蛋白改變，與對照組相比尿酸促進HK-2 細胞（圖2A 和圖2B）Cleaved-Caspase 3和Cleaved-Caspase 12 蛋白表達，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 尿酸促進腎小管上皮細胞凋亡 使用150 和200 mg∕L 濃度尿酸處理HK-2 細胞24 h，Annexin VFITC∕PI 雙染流式細胞儀測定細胞凋亡。對照組細胞凋亡率為（5.12±1.02）%，150和200 mg∕L 尿酸處理組細胞凋亡率分別為（23.69±3.62）%和（38.87±5.48）%（表1）。與對照組相比，差異具有統計學意義（P＜0.01）。

圖1 尿酸抑制腎小管上皮細胞增殖Fig.1 Uric acid inhibits the proliferation of renal tubular epithelial cells

2.4 尿酸通過IRE-1/JNK 信號通路激活內質網應激調節細胞增殖、凋亡 本研究發現尿酸抑制腎小管上皮細胞增殖并促進凋亡發生，但其分子機制未知。文獻［6］報道細胞內質網應激與增殖和凋亡存在密切聯系，本研究繼續探究尿酸和腎小管上皮細胞內質網應激之間的關系。實驗組150 mg∕L和200 mg∕L 濃度尿酸處理腎小管上皮細胞24 h，Western-blot 檢測發現腎小管上皮細胞BiP∕GRP78、IRE1 和JNK 蛋白表達上調（圖3A），說明尿酸激活腎小管上皮細胞內質網應激的發生。應用4-PBA（5 μmol∕L）阻斷內質網應激后合用尿酸處理，與尿酸處理組（200 mg∕L）相比Cleaved-Caspase-12 蛋白水平下調（圖3B），同時MTT實驗發現細胞存活率升高（P= 0.004）（圖3C），差異具有統計學意義（P＜0.01）。顯示4-PBA 能夠抑制尿酸引起的腎小管上皮細胞凋亡，尿酸通過內質網應激途徑發揮功能。

3 討論

尿酸是人體嘌呤代謝的產物，作為人體重要小分子由腎臟排出，流行病學發現長期高尿酸血癥是引起慢性腎臟病的重要因素［7］。隨著人們攝入富含嘌呤類或者蛋白質類食物的增加，高尿酸血癥發病率呈逐年升高［8］。高尿酸形成結晶沉積在腎小管-腎間質中，通過誘發機械性損傷或者炎癥反應導致腎功能損害［9］。

圖2 尿酸促進Cleaved-Caspase-3 和Cleaved-Caspase-12 蛋白表達Fig.2 Uric acid promotes the protein expression of Cleaved-Caspase-3 and Cleaved-Caspase-12

表1 尿酸對腎小管上皮細胞凋亡率的影響Tab.1 Effect of uric acid on apoptosis rate of renal tubular epithelial cells ±s

注：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

分組對照組150（mg∕L）尿酸200（mg∕L）尿酸凋亡率（%）5.12±1.02 23.69±3.62 38.87±5.48 P 值0.001**＜0.001***

圖3 尿酸通過IRE-1∕JNK 信號通路激活內質網應激調節細胞增殖、凋亡Fig.3 Uric acid activates endoplasmic reticulum stress through IRE-1∕JNK signaling pathway to regulate cell proliferation and apoptosis

腎小管上皮細胞富含尿酸轉運體，是尿酸代謝過程中的重要組成。腎小管上皮細胞凋亡增多是導致尿酸轉運障礙的重要因素［10］，本研究重點探討尿酸對腎小管上皮細胞增殖、凋亡能力的影響。不同濃度尿酸或者不同時間處理腎小管上皮細胞，MTT 實驗檢測細胞增殖能力發現尿酸抑制其增殖，且呈濃度依賴性和時間依賴性。同時使用Western blot 檢測不同濃度尿酸處理后凋亡蛋白水平改變，尿酸促進Cleaved-Caspase-3 和Cleaved-Caspase-12 蛋白表達。此外，通過流式細胞儀檢測尿酸處理后腎小管上皮細胞凋亡水平，發現尿酸促進其凋亡。高尿酸抑制腎小管上皮細胞增殖并促進其凋亡，既往文獻發現尿酸可激活線粒體途徑導致HK-2 細胞凋亡，加速腎臟病惡性進展，然而高尿酸引起HK-2 細胞凋亡的其他分子機制尚不清楚。內質網（endoplasmic reticulum，ER）在真核生物中普遍存在，其內環境的穩定是維持內質網正常生理功能的基本條件，但很多因素可導致內質網功能失衡，形成內質網應激（ER stress，ERs），例如缺血再灌注損傷、氧化應激、蛋白質過度錯誤折疊、內質網鈣代謝紊亂等［11］。內質網分子伴侶蛋白GRP78∕BiP 和IRE1 是ERs 過程中重要分子，生理條件下兩者結合而失活，而ERs 發生時兩者分離而激活下游信號通路［12］。當ERs 長期存在時，會引起細胞凋亡。IRE1 是介導內質網應激引起細胞凋亡的關鍵分子，通過與合腫瘤壞死因子受體相關因子2（TNF receptor associated factor，TRAF2）和凋亡信號調節激酶（apoptosis-signaling kinase 1，ASK1）結合形成TRAF2-ASK1-JNK 復合體，激活下游JNK 信號通路引起細胞凋亡［17］。本研究通過Western-blot 檢測不同濃度尿酸處理后腎小管上皮細胞BiP∕GRP78、IRE1 和JNK 蛋白改變，發現BiP∕GRP78、IRE1 和JNK 蛋白表達升高，說明尿酸激活腎小管上皮細胞內質網應激。然而尿酸是否通過激活內質網應激調節增殖和凋亡卻不能確定，本實驗使用4-PBA 阻斷內質網應激后再使用尿酸處理，發現Cleaved-Caspase-12 蛋白水平下調，同時細胞存活率升高，證實了尿酸通過內質網應激途徑發揮功能。

綜上所述，尿酸抑制腎小管上皮細胞增殖并促進其凋亡，并發現尿酸通過激活內質網應激是其可能的分子機制，阻斷內質網應激治療高尿酸血癥引起的慢性腎臟病具有臨床應用價值，進一步深入探討尿酸損傷腎小管上皮細胞的分子機制，將有可能為高尿酸血癥的綜合治療帶來新的選擇。