地衣芽孢桿菌對非酒精性脂肪肝病的干預作用及對腸黏膜通透性的影響

宋獻美 吳曉東 石科 許波

1河南醫學高等專科學校微生物與免疫教研室（鄭州451191）；2鄭州大學附屬兒童醫院（鄭州兒童醫院）病理科（鄭州450018）

隨著生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝病 （non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）已成為威脅人類健康的重要疾病。流行病學數據顯示，NAFLD的發病率不斷上升且呈現低齡化的趨勢［1］，且其中10%～15% 的NAFLD 患者最終發展為肝硬化甚至肝癌［2］。因此，有效的預防及治療NAFLD 具有重要的意義。微生態學研究發現腸道菌群可通過“腸-肝循環”干預肝病的發生、發展，有望成為治療NAFLD 的新手段［3］。目前常用的益生菌大部分必須低溫冷藏保存，而地衣芽孢桿菌耐熱，常溫保存即可，并以芽孢形式通過高酸胃環境，到達腸道后萌發成活菌發揮作用［4］。臨床研究表明地衣芽孢桿菌治療NAFLD 療效確切，但其作用機制不明。本研究通過NAFLD 大鼠模型，觀察地衣芽孢桿菌對大鼠肝功能、血脂、肝組織病理學及小腸中緊密連接蛋白表達的影響，探討地衣芽孢桿菌治療NAFLD 的作用及機制，為臨床提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 地衣芽孢桿菌（青島東海藥業有限公司）；丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、二胺氧化酶（DAO）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；顯色基質鱟試劑盒（廈門鱟試劑生物科技股份有限公司）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；緊密連接蛋白（Occludin）、閉鎖小帶蛋白-1（ZO-1）多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；高脂飼料（83.25% 基礎飼料+10% 豬油+1.5%膽固醇+5%蔗糖+0.2%脫氧膽酸鈉+0. 05%丙硫氧嘧啶，江蘇省協同醫藥生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備與分組給藥 40 只雄性Wistar 大鼠適應性喂養1周后，按體質量隨機分為4組：正常（Con）對照組、模型對照（Mod）組、地衣芽孢桿菌低（BLL，2.5 × 107CFU∕kg）、高劑量（BLH，5.0 × 107CFU∕kg）組，每組10 只大鼠。分組后Con組給予普通飼料喂養，Mod組、BLL、BLH組用高脂飼料喂養建立NAFLD 模型［5］。從第8 周開始灌胃相應藥物，正常組和模型組灌胃蒸餾水，每天1 次，連續5周。

1.2.2 生化指標測定 末次給藥后禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血，離心分離血清，按照試劑盒說明檢測血清中ALT、AST、TC 和TG 的水平。

1.2.3 肝臟組織病理檢測 取血后分離大鼠肝臟，在肝右葉離邊緣1 cm 處橫切取肝組織經中性甲醛固定，石蠟包埋后切片，常規HE 染色，于顯微鏡下觀察肝組織病理學形態。

1.2.4 血清中ETX、DAO 和肝臟中TNF-α 檢測采用比色法按照試劑盒說明書檢測血清中DAO 的活性；采用鱟試劑法檢測血清中ETX的含量；取150 mg 肝組織加450 μL 生理鹽水制備肝勻漿，取勻漿液用ELISA 法檢測TNF-α的含量。

1.2.5 免疫組織化學檢測小腸中Occludin、ZO-1的表達 分離大鼠小腸組織，中性甲醛固定，脫水、包埋，切片，二甲苯脫蠟后乙醇水化，抗原修復后分別滴加Occludin、ZO-1 一抗（1：500），SABC 法孵育二抗，DAB 顯色后復染，顯微鏡下觀察，細胞胞漿染成棕黃色為陽性細胞。每張切片隨機取3 個視野，用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件分析Occludin、ZO-1 免疫反應陽性的平均光密度值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0 軟件進行統計分析，數據以均數±標準差表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較用LSD 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生化指標結果 與Con組比較，模型組大鼠血清中各項指標水平明顯升高（P＜0.05）。與Mod組比較，BLLL、BLH組大鼠血清ALT、AST 活性明顯降低，TC、TG 含量明顯減少（P＜0.05），且地衣芽孢桿菌實驗組大鼠血清中生化指標水平隨著地衣芽孢桿菌劑量的增加而減少。見表1。

表1 大鼠血清中ALT、AST、TC 和TG 的水平Tab.1 The contents of ALT，AST，TC and TG in serum（n=10） ±s

表1 大鼠血清中ALT、AST、TC 和TG 的水平Tab.1 The contents of ALT，AST，TC and TG in serum（n=10） ±s

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

組別Con Mod BLL BLH ALT（U∕L）44.76±9.13 85.20±18.82*68.21±15.23△59.36±11.90△AST（U∕L）98.35±22.60 176.24±35.39*144.53±29.08△132.84±26.56△TC（mmol∕L）1.46±0.29 3.31±0.86*2.73±0.60△2.25±0.53△TG（mmol∕L）0.58±0.22 1.53±0.43*1.06±0.32△0.84±0.28△

2.2 肝組織病理學 HE 染色顯示，Con組大鼠肝小葉結構完整清晰，可見呈放射狀排列的肝索，肝細胞排列整齊，體積正常，界限清楚，無脂肪變性；Mod組大鼠肝小葉結構紊亂，小葉內肝細胞腫脹，呈中大泡性脂肪變性，內有大小不等的脂滴，小葉內可見肝細胞點狀壞死，匯管區及小葉內炎癥細胞浸潤；BLL、BLH組大鼠肝細胞腫脹程度減輕，細胞內脂滴數量減少，可見少量炎癥細胞浸潤，肝索結構明顯改善。見圖1。

2.3 血清中ETX、DAO 和肝中TNF-α 的水平與Con組比較，模型組大鼠血清中各項指標水平明顯升高，肝組織中TNF-α 含量增加（P＜0.05）。與Mod組比較，BLL、BLH組大鼠血清ETX、DAO 水平明顯降低，肝組織中TNF-α 含量明顯減少（P＜0.05）。見表2。

圖1 各組大鼠的肝組織病理（HE，×200）Fig.1 Pathomorphology of liver tissues in NAFLD rats（HE staining，×200）

表2 大鼠血清中ETX、DAO 和肝中TNF-α 的含量Tab.2 The contents of ETX、DAO in serum and TNF-α in liver（n=10） ±s

表2 大鼠血清中ETX、DAO 和肝中TNF-α 的含量Tab.2 The contents of ETX、DAO in serum and TNF-α in liver（n=10） ±s

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

組別Con Mod BLL BLH ETX（EU∕L）116.03±16.82 212.56±33.61*180.85±28.87△153.72±25.36△DAO（U∕L）3.93±1.40 13.09±3.63*9.89±2.94△7.56±2.15△TNF-α（pg∕mg）2.17±0.40 4.32±0.75*3.30±0.62△2.81±0.55△

2.4 各組大鼠小腸Occludin、ZO-1 蛋白表達Con組、Mod組、BLL組和BLH組大鼠小腸組織中Occludin的表達平均光密度分別為0.196 3±0.027 6、0.163 8±0.019 2、0.180 4±0.023 9、0.189 6±0.025 1；Zo-1 的表達平均光密度分別為0.215 6±0.026 8、0.177 5±0.019 1、0.198 9±0.021 1、0.206 2±0.023 7。Mod組大鼠Occludin、ZO-1 蛋白表達較Con組明顯減少（P＜0.05），與Mod組比較，BLL組大鼠ZO-1 表達明顯增加，BLH組大鼠Occludin、ZO-1 蛋白均顯著增加（P＜0.05）。見圖2、3。

圖2 各組大鼠的小腸組織中Occludin 的表達（×200）Fig.2 The expression of Occludin in small intestine of NAFLD rats（×200）

圖3 各組大鼠的小腸組織中Zo-1 的表達（×200）Fig.3 The expression of Zo-1 in small intestine of NAFLD rats（×200）

3 討論

隨著人們生活方式和飲食結構的改變，NAFLD發病率呈逐年上升趨勢。NAFLD 可能與高脂飲食、胰島素抵抗及遺傳易感性密切相關，過多的脂肪在肝臟堆積，而肝細胞一方面從血液中攝取脂肪酸合成TG，另一方面是以極低密度脂蛋白的形式將TG 轉運出肝細胞。不論任何步驟發生異常都會引起肝細胞脂肪合成能力增加和（或）轉運入血能力降低，從而導致肝內脂質沉積、肝細胞脂肪變性，肝細胞出現炎癥壞死，導致NAFLD 的發生［6］。本研究采用高脂飲食誘導動物模型，結果顯示高脂飼料喂養大鼠肝組織小葉結構紊亂，肝細胞腫脹，出現脂肪變性，可見肝細胞點狀壞死，血清TC和TG 水平明顯升高，表明大鼠脂質代謝紊亂，NAFLD 疾病模型建立成功。

腸道菌群失調可能是NAFLD 發生的關鍵環節，NAFLD 患者腸存在腸道菌群失調的現象［7］。腸道中革蘭陰性菌增加，內源性乙醇生成增多，內源性乙醇誘導致炎性細胞因子的分泌，激活巨噬細胞進而引起腸道屏障功能受損，腸黏膜通透性增加［8］。大量內毒素易位經門脈系統進入肝臟，激活肝臟Kupffer 細胞，釋放TNF-α等炎性介質，引發炎癥瀑布反應，對肝細胞形成“二次打擊”，損傷肝細胞，影響其代謝、分泌功能，引起膽汁分泌障礙。膽汁分泌異常會影響脂肪的正常代謝，脂肪異常堆積導致肝細胞脂肪變性，最終形成NAFLD［9］。因此，調節腸道菌群平衡可改善肝功能，阻止NAFLD 的發生［10］。地衣芽孢桿菌可以造成腸道環境低氧狀態，支持腸道內優勢菌群生長（如雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌、消化鏈球菌等），同時低氧環境會抑制好氧致病菌，進而調節腸道菌群的平衡。本研究發現NAFLD 大鼠血清中內毒素水平和肝勻漿中TNF-α含量明顯高于正常大鼠，地衣芽孢桿菌干預后，NAFLD 大鼠血清中ALT、AST 活性和TC、TG 水平降低，肝組織中TNF-α含量減少，肝組織病理學損傷明顯改善，表明地衣芽孢桿菌對非酒精性脂肪肝病具有保護作用。

腸黏膜的通透性可反映腸道屏障功能。DAO是存在于腸黏膜上層絨毛細胞胞漿中的內酶，腸黏膜損傷后DAO 釋放進入血液，導致血液中DAO活性增高。通過檢測血清中DAO 活性可間接反映腸道的屏障功能變化［11］。腸道屏障功能是主要由腸道黏膜的機械屏障、免疫屏障、化學屏障和生物屏障組成，最重要的是機械屏障。機械屏障由上皮細胞及細胞間緊密連接構成，緊密連接決定了腸黏膜通透性［12］。組成緊密連接的蛋白眾多，其中最重要的是Occludin、Zo-1，Occludin 與胞漿中其他蛋白形成緊密連接的基本結構，調控細胞的跨上皮電阻和膜轉運功能［13］，Zo-1 則是連接Occludin 與胞內骨架的關鍵分子，對腸上皮起穩定作用［14］。緊密連接蛋白的破壞會導致腸黏膜通透性增高，使內毒素、細菌等從腸腔移位進入血液。本研究發現NAFLD 大鼠血清中DAO 活性升高，說明NAFLD 大鼠腸黏膜通透性增加，腸道屏障受損。地衣芽孢桿菌干預后，血清中DAO 活性降低，腸道中緊密連接Occludin、Zo-1 表達增加，表明地衣芽孢桿菌可通過調節緊密連接的表達改善腸黏膜的通透性，保護腸道屏障。

綜上所述，地衣芽孢桿菌可增加腸道緊密連接蛋白的表達，改善腸黏膜的通透性，減少內毒素的腸滲漏，緩解肝臟脂肪變性，保護NAFLD 肝臟功能。本研究的創新之處為基于腸道菌群失調可能是NAFLD發生的關鍵環節，通過地衣芽孢桿菌糾正腸道菌群紊亂，保護腸道屏障功能，從而對NAFLD產生改善作用。由于受條件限制，本研究未觀察地衣芽孢桿菌對NAFLD 大鼠腸道菌群改變的影響，因此，需要通過更深入的試驗來解決上述問題，為地衣芽孢桿菌治療NAFLD 提供更充分的依據。