毛蕊異黃酮抑制壓力超負荷大鼠心肌肥厚及對JAK∕STAT 信號通路的影響

黃璟 成傳訪 李惠波 羅燕華 區文超

廣州醫科大學附屬第二醫院1心內科（廣州心血管疾病研究所），2 超聲科（廣州510260）

心肌肥厚是機體對生理和病理狀態的適應反應，結果導致心室重構。許多研究已經證實心室重構是引起心血管疾病發生率和死亡率顯著升高的獨立危險因素［1-2］。因此防治心肌肥厚進展到心室重構具有重要意義［3］。近年來發現酪氨酸激酶∕信號轉導子和轉錄激活子（janus kinase∕signal transducer and activator of transcription，JAK∕STAT）信號通路在心肌肥厚的發生發展中起著重要的作用，它是壓力負荷激活心肌肥厚的主要信號通路［4-6］。目前臨床上治療心肌肥厚的藥物有限、效果不佳，不良反應較多。傳統中醫藥為天然成分，具有副作用低、安全、多效的特點，可和西醫治療有機結合［7］。而現今傳統中藥多是配方制劑，成分復雜，作用靶點并不明確，難以標準化和國際化。因此尋找高純度、安全、有效的中藥單體逆轉心肌肥厚，成為目前國內中醫藥研究的一大課題。毛蕊異黃酮是從傳統中藥黃芪中提取分離得到的一種主要單體成分，是黃芪提取物的主要有效生物化學成分之一，在心肌肥厚中的作用尚不明確。本研究探討了毛蕊異黃酮在壓力負荷大鼠心肌肥厚中的作用，以及對JAK∕STAT 信號通路的影響。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級SD 大鼠由廣東省醫學實驗動物中心提供，共24 只，雌雄各半，體質量180～220 g。

1.2 實驗材料與試劑 毛蕊異黃酮及DMSO 溶劑（sigma 公司），JAK1、STAT3、β-actin 一抗（CST 公司）。

1.3 分組與處理 大鼠隨機分為腹主動脈縮窄組（TAAC組），TAAC+溶劑對照組（vehicle組）以及TAAC+毛蕊異黃酮處理組（calycosin組），術后1 周開始腹腔給藥。vehicle組及calycosin組每天分別給予等量溶劑或毛蕊異黃酮［1 mg∕（kg·d），n= 8］。8 周后行超聲心動圖、左室有創壓檢查，取心臟組織行Western Blot 檢測JAK1、STAT3 蛋白表達量。

1.4 腹主動脈縮窄壓力超負荷心肌肥厚模型制備（TAAC 術） SD 大鼠稱重后腹腔注射10%水合氯醛200～300 mg∕kg 麻醉后固定，醫用酒精消毒皮膚，縱行開腹，于左腎動脈上方鈍性分離腹主動脈，沿血管走行方向放置直徑0.6 mm 鈍性鋼絲與腹主動脈一起結扎后迅速抽出針頭，使腹主動脈形成固定縮窄，關腹。術后3 d 內予腹腔注射青霉素（18 000 U∕kg）預防感染。

1.5 超聲心動圖檢查 大鼠稱重后，10%水合氯醛麻醉（200～300 mg∕kg，腹腔注射），剔除大鼠胸部毛發。以Philips iE33 超聲診斷儀行超聲心動圖檢查。L15-7io術中探頭，左心室橫切面分別測量室間隔厚度（IVS）、左心室舒張末期內徑（LVEDD）、左心室后壁厚度（LVPW）、左心室收縮末期內徑（LVESD）、左心室舒張末期容積（LVEDV）、左心室收縮末期容積（LVESV），并計算左心室射血分數（LVEF）。

1.6 左心室有創壓檢測 大鼠稱重后，10%水合氯醛麻醉（200～300 mg∕kg，腹腔注射），切開頸部皮膚并暴露右頸動脈，PE50 導管行右頸動脈插管至左心室，Powerlab 數據采集分析系統（ADIn-struments，澳大利亞）記錄心室壓力波形，Labchart Pro（AD-Instruments，澳大利亞）分析左心室收縮末壓（LVSP）、舒張末壓（LVEDP）及心室內壓最大上升或下降速率（±dp∕dt max）。

1.7 左心室質量指數（LVMI）測定 電子天平測量空腹大鼠體質量，左心室測壓完成后處死大鼠后分離出左心室，濾紙吸干水分后電子天平稱重，計算大鼠LVMI=左心室質量（mg）∕體質量（g）。

1.8 心臟組織JAK1 及STAT3 蛋白表達的檢測取100 mg 心臟組織，加入少量液氮快速研磨后，加入蛋白裂解液，冰浴裂解20 min，14 000g，4 ℃離心20 min，取上清，BCA 法蛋白定量。制膠，上樣，電泳后冰上轉膜，洗膜后10%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入相應一抗（1∶1 000 稀釋），4 ℃孵育過夜，洗膜后加入ECL 發光底物，暗室壓片曝光。內參蛋白為β-actin。Image-Pro Plus 6.0 軟件分析蛋白灰度。

1.9 統計學方法 使用SPSS 18.0 進行統計分析研究數據以均數±標準差表示，兩樣本均數的比較采用獨立樣本t檢驗，多組樣本均數的比較采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠超聲心動圖參數 TAAC 術大鼠壓力超負荷造模成功，腹腔連續給藥8 周后，與TAAC組及vehicle組相比較，Calycosin組大鼠IVS、LVPW明顯減?。≒＜0.01），LVEDD 及LVESV 均明顯增大（P＜0.05），LVEDV 明顯增加（P＜0.01）；與TAAC組及vehicle組相比較，Calycosin組大鼠LVESD 有增大，但差異無統計學意義（P＞0.05）；各組大鼠LVEF 差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 大鼠超聲心動圖參數比較Tab.1 Comparison of echocardiographic parameters in rats±s

表1 大鼠超聲心動圖參數比較Tab.1 Comparison of echocardiographic parameters in rats±s

組別TAAC組Vehicle組Calycosin組IVS（cm）0.195±0.013 0.189±0.011 0.158±0.009#LVEDD（cm）0.521±0.038 0.551±0.023 0.625±0.090*LVPW（cm）0.223±0.022 0.201±0.026 0.169±0.027#LVESD（cm）0.231±0.047 0.228±0.041 0.241±0.026 LVEDV（mL）0.371±0.063 0.383±0.057 0.581±0.027#LVESV（mL）0.047±0.031 0.053±0.028 0.081±0.018*LVEF（%）89.4±3.6 88.3±3.2 86.1±4.7

2.2 LVMI 的變化 與TAAC組及vehicle組比較，Calycosin組LVMI 顯著降低（P＜0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠左心室有創壓比較 與TAAC組及vehicle組比較，Calycosin組大鼠左心室舒張末壓無明顯改變（P＞0.05），左心室收縮末壓明顯下降（P＜0.05），±dp∕dt max 值明顯升高（P＜0.05）。見表3。

2.4 各組大鼠心臟組織JAK1、STAT3 蛋白表達情況 腹腔給藥8 周后，處死大鼠，取出心臟組織，WB 檢測提示，與TAAC組及vehicle組比較，Calycosin組大鼠心肌組織JAK1 及STAT3 蛋白表達量明顯降低（P＜0.05）。見圖1。

表2 大鼠LVMI 的變化Tab.2 Changes of left ventricular mass index（LVMI）in rats ±s

表2 大鼠LVMI 的變化Tab.2 Changes of left ventricular mass index（LVMI）in rats ±s

注：*與TAAC組及vehicle組比較，Calycosin組LVMI 顯著降低（P＜0.05）

組別TAAC組Vehicle組Calycosin組LVMI（mg∕g）2.45±0.16 2.38±0.18 2.21±0.21*

表3 大鼠左心室有創壓比較Tab.3 Comparison of left ventricular invasive pressure in rats±s

表3 大鼠左心室有創壓比較Tab.3 Comparison of left ventricular invasive pressure in rats±s

注：與TAAC組及vehicle組比較，*P＜0.05

組別TAAC組Vehicle組Calycosin組LVEDP（mmHg）2.97±1.86 3.52±1.91 3.15±1.79 LVSP（mmHg）151.14±6.28 149.47±7.13 136.09±8.32#+dp∕dtmax（mmHg∕s）5912±378 5984±335 6375±385*-dp∕dtmax（mmHg∕s）5459±427 5527±409 5981±411*

3 討論

心肌肥厚是由心肌損害所引起的一系列慢性、進行性病理生理變化，它主要表現為心肌細胞的肥大、質量∕容量比增加、室壁張力指數增加和間質成分的改變，結果是心肌過度伸長，心肌細胞壞死和左室擴張、導致心室重構。心肌肥厚常常發生在高血壓、缺血性心臟病和心力衰竭。它是心肌細胞對機械、神經激素和炎癥因子刺激的主要反應之一，表現為心肌細胞的體積增大、蛋白合成增加和橫紋肌結構的改變，并沒有心肌細胞數量的增多。這種改變使心肌細胞收縮力增強，從而提高心輸出量。最初心肌的肥厚是為了保持最優化的生物力學應力和正常的心臟泵功能，但是這種不正常的增生最后使心臟功能失調。最初作為心肌適應性反應的心肌肥厚，最后常常導致心室重構、心室擴大和心力衰竭甚至死亡。心肌肥厚所致心室重構已被證實是引起心血管疾病發生率和死亡率顯著升高的獨立危險因素。

圖1 大鼠心臟組織JAK1、STAT3 蛋白表達情況Fig.1 The expression of JAK1 and STAT3 in rat heart

黃芪始載于《神農本草經》，味甘、性溫，有補氣升陽，固表止汗，托毒排膿，利水消腫和生肌等功效。臨床研究發現黃芪對心肌缺血∕再灌注損傷及病毒感染的心肌均具有明顯的保護作用，以及能改善心功能，對心力衰竭有明顯的治療效果［8-9］。多年來對單味黃芪、復方及黃芪的有效成分進行了大量的心血管藥理方面的研究及探討，發現黃芪提取物具有抑制心肌肥厚的作用，可能和其抑制炎癥因子防止脂質過氧化，清除氧自由基，提高線粒體活性以及抑制細胞內鈣超載等有關。有研究顯示黃芪能抑制異丙腎上腺素誘導的心肌細胞肥厚，還能逆轉壓力超負荷大鼠和腎性高血壓大鼠的左室肥厚。對壓力超負荷大鼠黃芪能改善心功能，減輕心肌組織水腫［8-11］。黃芪提取物還可明顯改善大鼠心肌梗死后異常的血液流變學指標、組織病變及膠原纖維構成比例［12］。黃芪提取物含有多種化學成分，包括有黃酮類、皂甙類、多糖類、氨基酸以及微量元素，其成分復雜，作用靶點并不明確，難以標準化和國際化。

心肌肥厚病理生理過程中，主要信號轉導通路是絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、鈣調蛋白依賴的磷酸酶（calmodulin-dependent phosphatase）以及JAK∕STAT信號通路［13-15］。JAK∕STAT 信號通路在近年來備受重視。許多致心肌肥厚刺激信號均能激活心肌JA K∕STA T 信號通路，如：AngII、IL-6、TNF- α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、CT-1、壓力負荷等［16］。AK∕STAT信號通路在壓力負荷介導的心肌肥厚中的作用機制尚未完全闡明，可能與促進ANP 基因表達、Ang II 自分泌增加相關。文獻報道，TAAC 心臟肥厚大鼠模型JAK∕STAT 信號通路激活，富氫鹽水抑制心肌肥厚的同時降低了JAK∕STAT 信號通路活性［17］。在本研究中，毛蕊異黃酮減輕TAAC 大鼠心臟肥厚的同時，心臟組織中JAK∕STAT 信號通路活性明顯下降。

綜上所述，毛蕊異黃酮作為黃芪的主要生物活性成分，也具有抑制壓力超負荷大鼠的心室重構作用，其機制可能是通過降低JAK∕STAT 信號通路活性，這一發現為改善慢性心力衰竭患者心室重構提供了新的治療思路。