胸腺素β4對大鼠腦缺血再灌注損傷的神經保護作用

張忠勝 劉雙鳳 黃四春

清遠市人民醫院∕廣州醫科大學附屬第六醫院神經內科（廣東清遠511518）

急性腦梗死約占所有腦卒中類型的80%，具有高發病率、高致殘率和高致死率的特點。腦缺血發生后，腦組織氧化損傷及神經細胞凋亡增加。胸腺素β4（thymosin β4，Tβ4）是由43 個氨基酸殘基組成的多肽，具有促進干細胞分化，增強細胞增殖、遷移，抗凋亡，促進血管生成等多種生物學功能，與組織再生、血管生成和創傷愈合密切相關［1-3］。多個研究提示Tβ4 具有神經保護作用，能增加脊髓損傷大鼠神經元和少突膠質細胞數量，降低促炎細胞因子基因表達［4］，改善腦缺血大鼠的神經損傷癥狀［5］，有效抑制體外氧糖剝奪∕復糖復氧誘導的神經細胞凋亡和自噬［6］。而Tβ4 對局灶性缺血再灌注損傷SD 大鼠的氧化損傷和神經元凋亡作用仍不清楚。本研究采用改良線栓法制作大鼠大腦中動脈阻塞缺血再灌注模型，應用腹腔注射Tβ4，探討Tβ4 對腦缺血再灌注損傷大鼠神經功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 Tβ4 重組蛋白購自CLOUDCLONE CORP（USA）。脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNNEL）凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物公司（中國）。2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）Stain kit、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。其余試劑為國產分析純。

1.1.2 儀器 倒置顯微鏡（XDZ-103CED），上海領成生物科技有限公司產品；L6 紫外分光光度計，上海精密科學儀器有限公司產品；DNM-9602G 酶標儀分析儀，北京普朗新技術有限公司產品。

1.1.3 動物 清潔級健康雄性SD 大鼠（體質量250～300 g，7～8 周齡）購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（滬）20130016。

1.2 研究方法

1.2.1 動物分組與建模 所有SD 大鼠均于室溫下正常喂養。根據隨機數字表法將48 只SD 大鼠隨機分為3組：假手術組（Sham組）、缺血再灌注組（I∕R組）和Tβ4 干預組（Tβ4組），每組16 只。Sham組大鼠頸內動脈僅被隔離，不栓塞大腦中動脈，然后縫合切口。模型制備參考改良Zea-Longa 線栓法［7］，I∕R組和Tβ4組大鼠予尼龍線栓塞大腦中動脈2 h 后復通。Tβ4組大鼠在大腦中動脈阻塞前后各1 h 分別腹腔注射Tβ4（8 μg∕kg）［8］，Sham組和I∕R組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2 Longa 評分法進行神經功能評分［7］各組大鼠均在腦缺血再灌注24 h 后進行神經功能評分。0 分：沒有神經損傷的癥狀；1 分：不能完全伸展對側前爪；2 分：大鼠向對側轉圈；3 分：向對側傾倒；4 分：不能自行行走，失去意識。分數越高表明神經功能障礙越嚴重。只有評分在1～3 分的大鼠被納入后續實驗。

1.2.3 TTC 染色法測定各組大鼠腦梗死體積 將實驗大鼠斷頭取腦并用鹽水洗滌腦組織，然后將腦組織在-20 ℃冷凍20 min，收集2 mm 厚度的腦組織冠狀切片，并立即將切片在含有2%TTC 的PBS緩沖液中培養，37 ℃避光孵育30 min，隨后在4%甲醛溶液中固定24 h。取出固定好的腦片，將標本按組排列拍照，腦片中白色部分為梗死腦組織，采用Image-proplus 6.0 軟件測量并計算腦切片梗死體積及與總體積的百分比。

1.2.4 TUNEL 法檢測缺血區神經元凋亡情況 按照試劑盒說明書進行操作，石蠟切片脫蠟、烘片、乙醇水合，二氨基聯苯胺鏡下顯色、水洗、蘇木素復染。甘油封片后熒光顯微鏡下觀察，從每個切片的缺血半暗帶區域中隨機選取5 個視野，采用圖像分析軟件計算相應區域TUNEL 陽性細胞。正常細胞核為藍色熒光，凋亡細胞核為綠色熒光。計算細胞凋亡指數=凋亡細胞數∕總細胞數×100%。

1.2.5 化學比色法檢測MDA 含量和SOD、GSHPx 活性 于缺血2 h 再灌注24 h 后處死大鼠，斷頭，取出缺血再灌注側腦組織，沖洗干凈后稱重。用生理鹽水預冷，制備腦組織勻漿液（10%），離心（4 000 r∕min，10 min）后取上清，采用化學比色法檢測腦組織MDA 含量和GSH-Px、SOD 活性，相關具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.3 統計學方法 用SPSS 17.0 軟件進行統計分析。計量資料用x±s表示，多組間均數比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 缺血2 h 再灌注24 h 后各組大鼠神經功能評分比較 造模前3組大鼠Longa 評分均為0，表明3組大鼠基線相同。缺血2 h 再灌注24 h 后，I∕R組Longa評分顯著高于Sham組（表1），說明大鼠局灶性腦缺血再灌注模型構建成功。與I∕R組相比，Tβ4組Long 評分顯著降低（表1）。

表1 大鼠腦缺血再灌注后神經功能評分、腦梗死體積及細胞凋亡指數比較Tab.1 Comparison of neurological function score，cerebral infarction volume and apoptotic index in different groups x±s

2.2 大鼠腦缺血再灌注后腦梗死體積變化 腦缺血2 h 再灌注24 h 后，對各組大鼠腦組織進行TTC染色。在Sham組中，腦切片全部是紅色的，沒有觀察到梗死區。然而，I∕R組和Tβ4組存在一些白色梗死區域，與動脈栓塞范圍一致。結果顯示，與Sham組相比，I∕R組和Tβ4組腦梗死體積顯著增加，Tβ4組腦梗死體積顯著小于I∕R組（表1、圖1）。

圖1 Tβ4 對SD 大鼠腦梗死體積的影響Fig.1 The effects of thymosin β4 on cerebral infarction volume in SD rats

2.3 大鼠腦梗死周邊區細胞凋亡指數比較TUNNEL 法檢測凋亡結果顯示，I∕R組凋亡率顯著高于Sham組。與I∕R組比較，Tβ4組細胞凋亡指數顯著降低（表1）。

2.4 各組大鼠腦組織SOD、GSH-Px 活性和MDA含量比較 與Sham組比較，I∕R組腦組織中SOD和GSH-Px 活性顯著降低，而MDA 含量顯著升高；與I∕R組 比 較，Tβ4組SOD 和GSH-Px 活性升高，MDA 含量降低（表2）。

表2 大鼠腦缺血再灌注后SOD、GSH-Px 活性和MDA 含量變化Tab.2 SOD，GSH-Pxactivity and MDA content after cerebral ischemia-reperfusion in rats ±s

表2 大鼠腦缺血再灌注后SOD、GSH-Px 活性和MDA 含量變化Tab.2 SOD，GSH-Pxactivity and MDA content after cerebral ischemia-reperfusion in rats ±s

注：與Sham組比較，#P＜0.05；與I∕R組比較，*P＜0.05

組別Sham組I∕R組Tβ4組SOD（U∕mgprot）116.82±12.62 75.20±11.71#94.97±10.31#*GSH-Px（U∕mgprot）73.54±8.77 40.17±7.15#61.15±10.31#*MDA（nmol∕mgprot）6.92±0.74 12.15±1.75#8.17±0.91#*

3 討論

氧化損傷被認為是腦缺血∕再灌注損傷的重要因素之一［9-12］，腦缺血再灌注損傷后，氧化系統和抗氧化系統的平衡被破壞，機體產生大量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），ROS 引起膜脂質過氧化反應，導致機體發生病理性損傷。MDA、GSH-Px 和SOD 與氧自由基密切相關［13-15］，SOD 和GSH-Px 是體內對抗ROS 過多產生的兩種主要抗氧化酶，能清除氧自由基，起到保護機體免受氧化損傷的作用，二者活力的高低能夠反應機體清除氧自由基能力和抗氧化能力。MDA 為脂質過氧化產物，其含量與氧自由基含量呈正相關，可以反映機體內脂質過氧化水平及受氧化應激損害的程度。

如前所述，Tβ4 是一種由43 個氨基酸殘基組成的小分子多肽，在機體廣泛分布，近年來多位學者報道了其神經保護作用，可作為神經損傷和神經退行性疾病的修復∕再生療法［16］，改善3 個月齡大鼠栓塞性卒中模型的神經功能［17］，可促進中樞神經系統脫髓鞘疾病中的少突膠質細胞生成［18］。MORRIS 等［19-20］的研究發現，Tβ4 治療可以減少老年雄性Wistar 大鼠腦梗死體積，改善大腦中動脈栓塞后卒中大鼠的神經功能。本研究發現，Tβ4干預可減少腦梗死體積9%左右，改善大腦中動脈栓塞后SD 大鼠的神經功能，與MORRIS 等［19-20］的報道一致。為了進一步分析Tβ4 改善神經功能的機制，實驗進一步分析了與氧化損傷相關的SOD、GSH-Px 和MDA 含量，結果發現，Tβ4 處理顯著降低了MDA 含量，顯著上調了GSH-Px 和SOD 的活性，提示減輕氧化損傷，清除氧自由基可能是Tβ4抑制神經細胞凋亡和改善神經功能的重要機制。綜上所述，Tβ4 可能通過降低MDA 含量，提高SOD、GSH-Px 的活性，清除氧自由基、減輕氧化損傷來抑制細胞凋亡、提高組織抗氧化能力，從而減少腦梗死體積，改善神經功能。

本研究結果提示，Tβ4 具有治療腦缺血的潛在臨床應用價值。然而，本研究僅在動物模型水平進行了探討，這也是本研究也有不足之處，下一步將在細胞模型水平進一步深入研究。