海藻酸鹽-殼聚糖/羥基磷灰石復(fù)合纖維敷料的制備及性能

張小林，黃 晨，靳向煜

(1. 江南大學(xué) 紡織服裝學(xué)院，江蘇 無錫 214122； 2. 東華大學(xué) 紡織學(xué)院，上海 201620)

海藻酸是從天然海藻中提取的一種線形多糖生物高分子材料，由β-D-甘露糖醛酸(M 單元)和α-L-古羅糖醛酸(G單元)兩種組份組成，以M-M、G-G、M-G 等多種形式排列，是通過1～4糖苷鍵連接而成的嵌段聚合物[1]。海藻酸因具有高生物相容性、無毒性等優(yōu)良性能，被廣泛用于傷口敷料、藥物釋放及組織工程等領(lǐng)域。海藻酸大分子結(jié)構(gòu)中G單元與Ca2+交聯(lián)形成特殊的“egg-box”結(jié)構(gòu)[2]，且相交聯(lián)的Ca2+可與Na+和K+發(fā)生離子交換，形成水溶性的海藻酸鹽。海藻酸鈣纖維敷料用于創(chuàng)面治療時，通過離子交換，從不溶性海藻酸鈣轉(zhuǎn)變成水溶性海藻酸鈉，吸收大量液體呈凝膠狀態(tài)，為傷口愈合提供相對安全潤濕的環(huán)境[3]。尤其治療洞穿性創(chuàng)面時，成凝膠性能可減少死腔，緩解病人疼痛癥狀，效果明顯[4]。

國內(nèi)外已展開對海藻酸鹽纖維[5-7]的研究。文獻(xiàn)[8]對海藻酸鈣纖維基本性能，如表觀形貌，物理參數(shù)及熱、力學(xué)性能等進(jìn)行了初步研究及表征。文獻(xiàn)[1]研究制備高強(qiáng)度海藻酸鹽纖維，并得出濕法紡絲的最佳工藝參數(shù)，同時表征纖維基本性能。文獻(xiàn)[9-10]研究海藻酸鹽纖維降解機(jī)理及影響降解性能因素，并對材料降解性能、力學(xué)性能、藥物釋放及抗菌性能作詳細(xì)闡述。文獻(xiàn)[11-13]以海藻酸為原料紡制微膠囊，將其作為藥物載體，并植入動物體內(nèi)做進(jìn)一步病理學(xué)分析。文獻(xiàn)[14]將不同相對分子質(zhì)量的海藻酸鈉高分子原料混合，控制相對分子質(zhì)量大小來調(diào)節(jié)海藻酸鹽凝膠的力學(xué)性能。目前主要以靜電紡、濕法紡絲和凍干法制備海藻酸鹽纖維支架等。

本文以海藻酸為主要原料并添加其他物質(zhì)，通過微流紡紡制新型海藻酸鹽復(fù)合纖維敷料，并對其降解性能、力學(xué)性能及生物毒性作評價，為后期用于傷口創(chuàng)面治療提供參考。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

海藻酸鈉(180947-100G，Sigma)；殼聚糖(Hyclone-SH30256，國藥)；羥基磷灰石(C10068615，麥克林)；氯化鈣(AR500ML，凌峰試劑)；乙醇(AR500ML，鴻盛)；去離子水；胰蛋白酶(0.25%，加拿大)；細(xì)胞培養(yǎng)液；磷酸緩沖液PBS(Hyclone-SH30256，國藥)；噻唑藍(lán)(MTT，美國)；二甲基亞砜(DMSO，美國)；人的成纖維皮膚細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞。

1.2 試驗(yàn)儀器

掃描電子顯微鏡(S-4800型，日本)；高強(qiáng)高模纖維強(qiáng)伸度儀(XQ-1C型，上海新纖儀器公司)；18 kW轉(zhuǎn)靶X射線衍射儀(D/max-2550VB-PC型，日本)；紅外光譜儀(Nicolet 6700型，美國)；酶標(biāo)儀(Synergy H1型，美國)；倒置顯微鏡(LEICA DMi1型，美國)。

1.3 海藻酸鹽基纖維敷料制備方法

將海藻酸鈉粉末溶于去離子水中，制備體積分?jǐn)?shù)為3%的海藻酸鈉溶液3份，并標(biāo)為A、 B、 C。往A溶液中加入0.1 mg殼聚糖粉末，B溶液中加入0.1 mg羥基磷灰石粉末。已配制的海藻酸鈉溶液A、 B、 C分別為芯層溶液，皮層溶液均為5%氯化鈣乙醇溶液，通過自制微流紡設(shè)備[9]紡制3種類型海藻酸鹽基纖維敷料，如表1所示。

表1 3種纖維芯-鞘流成分Table 1 Core-sheath ingredient of three kinds of fiber

1.4 海藻酸鹽基纖維敷料性能測試

1.4.1 表面形態(tài)表征

先使用手感目測法對纖維敷料的外觀形態(tài)進(jìn)行感官評價，然后采用掃描電子顯微鏡對纖維表面形態(tài)做進(jìn)一步觀察。

1.4.2 溶脹性能

室溫下將3種纖維敷料分別浸漬在磷酸鹽緩沖液中，在固定時間間隔取出樣品，用濾紙充分吸除纖維表面多余水分并稱量，用溶脹率(式(1))來表示纖維溶脹性能。

溶脹率=[(ms-mi)/mi]×100%

(1)

式中：ms為纖維敷料溶脹后質(zhì)量；mi為纖維敷料未溶脹前質(zhì)量。

1.4.3 降解性能

室溫下將3種纖維敷料分別浸漬在磷酸鹽緩沖液中，在固定時間間隔取出樣品，充分脫水干燥并稱量，用質(zhì)量損失率(式(2))來表示纖維降解性能。

我國設(shè)施農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣的另一重要問題是缺乏資金的支持。設(shè)施農(nóng)業(yè)技術(shù)的推廣需要大量資金，設(shè)施農(nóng)業(yè)在全國范圍內(nèi)推廣效果欠佳，根本原因是農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新度不夠以及國內(nèi)農(nóng)業(yè)全面機(jī)械化需要不斷的資金支持。由于地方和國家的財(cái)政部門對于技術(shù)推廣沒有足夠的重視程度，在國家財(cái)政預(yù)算中未能將設(shè)施農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣納入其中，導(dǎo)致技術(shù)推廣資金支持不足。

質(zhì)量損失率=[(m0-m1)/m0]×100%

(2)

式中：m0為纖維敷料未浸漬前質(zhì)量；m1為纖維敷料降解后質(zhì)量。

1.4.4 紅外光譜及X-射線衍射分析

采用紅外光譜儀對纖維的光能團(tuán)進(jìn)行測試分析，采用X-射線衍射儀測定海藻酸鹽纖維的結(jié)晶度。

1.4.5 力學(xué)性能測試

在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境(溫度為(20±3)℃，相對濕度為(65±5)%)下，使用高強(qiáng)高模纖維強(qiáng)伸度儀對纖維的力學(xué)性能進(jìn)行測試，拉伸隔距為10 mm，預(yù)加張力為0.5 cN，拉伸速度為20 mm/min。

1.4.6 生物毒性評價

(1) 細(xì)胞增殖試驗(yàn)。3種纖維敷料各取50 mg分別浸漬在50 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中，放置在恒溫箱中孵化5 d，過濾所制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的纖維浸提液。分別將人體皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞按照5 000個/孔的濃度加入到96孔板中，在37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。每孔加入100 μL試樣液，空白組加入等體積培養(yǎng)基。在固定時間間隔內(nèi)，每孔加入10 μL MTT培養(yǎng)3.5 h。用移液槍吸去孔內(nèi)液體，每孔加入100 μL DMSO，于490 nm 測定吸光度[15-16]。細(xì)胞相對增殖率(RGR)=樣品吸光度/空白組吸光度×100%。

(2) 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)。人體皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞按照1×106個/孔的濃度接種到3 cm培養(yǎng)板，在37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長到90%后，用20 μL吸液管分別在培養(yǎng)板中劃痕，用移液槍吸去培養(yǎng)基，加入3 mL試樣液，空白對照組加入等體積培養(yǎng)基。在固定時間間隔內(nèi)取出培養(yǎng)板，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞遷移情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻酸鹽基纖維敷料的表面形貌特征

(a) SA

(b) SA-CS

(c) SA-HAP圖1 海藻酸鹽基纖維敷料的表面形態(tài)Fig.1 Morphological characterization of alginate-based fibrous dressings

2.2 海藻酸鹽基纖維敷料的溶脹性能和降解性能

3種海藻酸鹽基纖維敷料的溶脹性能和降解性能如圖2所示。

(a) 溶脹性能

(b) 降解性能圖2 3種海藻酸鹽基纖維敷料的溶脹性能和降解性Fig.2 Swelling behavior and degradation of threetypes of alginate-based fibrous dressings

由圖2(a)可知，海藻酸鹽纖維呈現(xiàn)優(yōu)異的溶脹性能，歸因于纖維中含有大量的—OH和—COOH。纖維浸漬在磷酸鹽緩沖液中，海藻酸鹽纖維中β-D-甘露糖醛酸(M)大分子基團(tuán)先吸收大量水分，當(dāng)達(dá)到飽和狀態(tài)時，纖維發(fā)生部分降解；此時α-L-古羅糖醛酸(G)大分子基團(tuán)“egg-box”結(jié)構(gòu)中與—COOH 交聯(lián)的Ca2+和溶液中Na+/K+發(fā)生離子交換，吸收更多的水分，最終導(dǎo)致“egg-box”結(jié)構(gòu)破裂，大量的水分子進(jìn)入到大分子鏈中，導(dǎo)致纖維降解[9]。由圖2可知，海藻酸鹽-殼聚糖復(fù)合纖維及海藻酸鹽-羥基磷灰石復(fù)合纖維的溶脹和降解性能均差于海藻酸鹽纖維。羥基磷灰石嵌入并均勻覆蓋在纖維表面，降低水分子浸入纖維內(nèi)部的趨勢，減弱纖維溶脹性能，進(jìn)而減緩纖維降解過程。殼聚糖是一種線性陽離子聚合物，殼聚糖大分子鏈中的—NH2和海藻酸鈣中的—COOH存在靜電作用，可以減少海藻酸中—COOH與Ca2+的交聯(lián)，降低了離子交換程度，導(dǎo)致海藻酸鹽-殼聚糖復(fù)合纖維呈現(xiàn)較低的溶脹及降解性能[9]。

2.3 海藻酸鹽基纖維敷料的力學(xué)性能

3種海藻酸鹽基纖維敷料的力學(xué)性能隨降解時間的變化如圖3所示。

(a) 斷裂伸長率

(b) 斷裂強(qiáng)度圖3 3種海藻酸鹽基纖維敷料的力學(xué)性能隨降解時間變化Fig.3 Mechanical performance of three types of alginate-basedfibrous dressings changes with degradation time

由圖3可知，3種纖維敷料的斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長率均隨著降解時間增加而減小。降解速度越快，纖維敷料斷裂強(qiáng)度損耗越大，3種纖維敷料斷裂強(qiáng)度對應(yīng)于其降解速度。羥基磷灰石覆蓋在纖維敷料表面，使纖維敷料剛度增強(qiáng)，導(dǎo)致海藻酸鹽-羥基磷灰石復(fù)合纖維敷料呈現(xiàn)最小斷裂伸長率；殼聚糖大分子鏈中—NH2與海藻酸鹽大分子鏈中的—COOH相交聯(lián)，減少了—COOH與Ca2+交聯(lián)，增加了纖維敷料柔度，導(dǎo)致海藻酸鹽-殼聚糖復(fù)合纖維敷料比海藻酸鹽纖維敷料呈現(xiàn)更大的斷裂伸長率。

2.4 海藻酸鹽基纖維敷料的紅外光譜及X-射線衍射分析

3種海藻酸鹽基纖維敷料的紅外光譜和X-射線衍射光譜如圖4所示。

(a) 紅外光譜

(b) X-射線衍射光譜圖4 3種海藻酸鹽基纖維敷料的紅外光譜和X-射線衍射光譜Fig.4 FTIR spectra and XRD patterns of three types ofalginate-based fibrous dressings

2.5 細(xì)胞增殖試驗(yàn)

醫(yī)用海藻酸鹽基纖維敷料的生物毒性評價極其重要，本試驗(yàn)采用人體皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞，通過細(xì)胞增殖試驗(yàn)和遷移試驗(yàn)對纖維敷料的細(xì)胞毒性進(jìn)行評價。3種纖維敷料浸提液處理的人體成纖維細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果分別如圖5和6所示，其中Control為空白對照組。由圖5和6可知，試驗(yàn)組中的OD 490值均大于對照組。由此可知，經(jīng)3種纖維敷料浸提液處理過的人體皮膚細(xì)胞存活率和對照組相當(dāng)，或略大于對照組。另外，海藻酸鹽纖維敷料、海藻酸鹽-殼聚糖復(fù)合纖維敷料及海藻酸鹽-羥基磷灰石復(fù)合纖維敷料對應(yīng)的人體成纖維細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞的相對增長率均大于75%，根據(jù)細(xì)胞毒性評級標(biāo)準(zhǔn)[15-16](如表2所示)可證明材料無生物毒性。

(a) 細(xì)胞增殖

(b) 細(xì)胞相對增長率圖5 3種纖維敷料浸提液處理的人體皮膚成纖維細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Results of fibroblasts proliferation treatedby three types of fibrous dressings extracted medium

(a) 細(xì)胞增殖

(b) 細(xì)胞相對增長率圖6 3種纖維敷料浸提液處理的人體皮膚角質(zhì)化細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Results of keratinocytes proliferation treatedby three types of fibrous dressings extracted medium

表2 細(xì)胞毒性評級標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Cytotoxicity grading criteria

(續(xù) 表)

2.6 細(xì)胞遷移試驗(yàn)

體外模擬人工劃痕試驗(yàn)用于表征材料對細(xì)胞遷移性能影響，以進(jìn)一步評價材料對細(xì)胞的毒性。3種纖維敷料對人體皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞遷移性能影響如圖7和圖8所示，其中Control為空白對照組。由圖7可知，經(jīng)3種纖維敷料浸提液處理過的劃痕，24 h后已長滿90%，與空白對照組中的細(xì)胞遷移速率基本相同。由圖8可知，經(jīng)試驗(yàn)組和對照組浸提液處理的劃痕，72 h后長滿90%。人工模擬細(xì)胞劃痕試驗(yàn)表明，海藻酸鹽-殼聚糖復(fù)合纖維敷料及海藻酸鹽-羥基磷灰石復(fù)合纖維敷料對人體皮膚細(xì)胞沒有明顯細(xì)胞毒性，相比空白對照組而言，試驗(yàn)組浸提液處理過的細(xì)胞遷移速率基本相同。

(a) 0 h

(b) 12 h

(c) 24 h圖7 3種纖維敷料浸提液處理過的人體皮膚成纖維細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Results of fibroblast migration in the scratched fibroblast free area after treated bythree types of fibrous dressings extracted medium

(a) 0 h

(b) 24 h

(c) 72 h圖8 3種纖維敷料浸提液處理過的人體皮膚角質(zhì)化細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果Fig.8 Results of keratinocyte migration in the scratched keratinocyte free area after treated by threetypes of fibrous dressings extracted medium

3 結(jié) 語

本文采用自制微流紡絲設(shè)備制備3種海藻酸鹽基纖維敷料，并通過溶脹率、質(zhì)量損失率和力學(xué)性能等測試，結(jié)果表明，海藻酸鹽-殼聚糖復(fù)合纖維敷料和海藻酸鹽-羥基磷灰石復(fù)合纖維敷料比純海藻酸鹽纖維敷料具有更慢降解速率及更強(qiáng)力學(xué)性能。由此表明，芯層流中殼聚糖或羥基磷灰石顆粒的加入可延緩纖維敷料降解周期，增強(qiáng)纖維敷料力學(xué)性能。另外，人體皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞增殖試驗(yàn)及遷移試驗(yàn)結(jié)果表明，3種復(fù)合纖維敷料均無細(xì)胞毒性，可為后期治療傷口創(chuàng)面提供理論參考依據(jù)。