飼料中轉基因大豆成分檢測

劉彥泓 劉岑杰

摘?要：

轉基因農作物的商品化滿足了人民日益增長的物質需求，但轉基因作物在食用安全性、對生態環境的影響等方面一直備受關注。本研究采用實時熒光PCR方法檢測飼料及飼料原料中轉基因大豆GTS40-3-2成分，可以準確、快速完成檢測，滿足飼料中轉基因成分的監管需求。實驗表明目前飼料中轉基因大豆GTS40-3-2成分的占有率較高，應引起相關部門的重視，加大監管力度。

關鍵詞：

飼料;轉基因大豆GTS40-3-2;實時熒光PCR

中圖分類號：S-3

文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20191230008

19世紀80年代興起的DNA重組技術得到了迅猛的發展和廣泛的應用。據統計表明：從1996年生物技術即轉基因作物商業化第1年以來到2018年底，全球轉基因作物的種植面積增長了約113倍，目前已經累計達到25億hm2。經統計顯示2018年有26個國家種植了約1.917億hm2轉基因作物，全世界有70個國家或地區應用了轉基因作物。我國是轉基因作物種植大國，2018年轉基因作物種植面積為290萬hm2，居世界第8位[1]。我國除了是轉基因作物的種植大國，也是轉基因農產品的進口大國。轉基因產品除了可能存在潛在的環境污染、生態風險，也可能對人類健康和自然環境帶來不利影響[2]。對轉基因產品的安全性，特別是轉基因食品對人和動物的健康以及對生態環境的影響，自轉基因技術出現以來，就是世界各國及聯合國等國際組織關心的焦點問題。因此轉基因產品的使用安全性問題一直是人們關心的問題，2002年歐盟要求對轉基因產品從生產、運輸、保存、銷售等過程進行全程的跟蹤和檢測[3]。目前已有幾十個國家和地區對轉基因產品采取強制性的標志管理制度。我國2002年3月20日起施行的《農業轉基因生物標識管理辦法》規定：轉基因農產品的直接加工品，標注為“轉基因××加工品（制成品）”或者“加工原料為轉基因××”。因此開展轉基因產品檢測，建立完善的檢測方法，對滿足轉基因生物安全監管要求、保證轉基因生物標識管理制度方面有重大意義。

目前國內外轉基因產品檢驗方法主要有2種：核酸水平的檢測和蛋白水平的檢測[4]。核酸檢測技術主要包括普通定性PCR檢測技術、實時熒光PCR檢測技術、數字PCR檢測技術、等溫擴增檢測技術、基因芯片檢測技術以及二代測序檢測技術等;蛋白檢測技術主要包括SDS聚丙烯凝膠電泳分析檢測技術、酶聯免疫分析檢測技術等[5]。另外，還有紅外光譜技術鑒別檢測方法等其他方法[6]。

本研究采用實時熒光PCR方法，檢測飼料中轉基因大豆GTS40-3-2成分，針對pCaMV35S、tNOS、GTS40-3-2品系特異基因進行檢測，選擇市場上市售的不同種類的飼料樣品進行檢測，表明完全可以滿足日常檢測需求，為飼料產品中轉基因大豆成分檢測提供檢測技術支持。

1?材料

1.1?原料及試驗樣品

所有原料和市售飼料樣品購自農村小型商店、寵物市場以及超市。原料為4種豆粕;市售飼料樣品4種，包括肉牛專用復合預混料、中豬預混料、產蛋雞飼料、通用型狗糧。轉基因大豆GTS40-3-2豆粉標準品為本實驗室保存。

1.2?主要試劑

樣本DNA提取采用試劑盒：Magnetic DNA Purification System For Food（Promega公司產品）;實時熒光PCR反應試劑：Premix Ex TaqTM （Probe qPCR）（Takara Bio公司產品）。

1.3?引物及探針序列

引物及探針合成、標記均為Takara Bio公司產品，引物及探針序列見表1。

1.4?主要儀器

低溫高速離心機（型號：5427R ），Eppendorf（艾本德中國有限公司）產品;實時熒光PCR儀（型號：QuantStudio 7Flex），Thermo Fisher Scientific Thermo Fisher Scientific（賽默飛世爾科技有限公司）產品。

2?方法

2.1?模板DNA的提取

將樣品分別研磨成粉后采用Promega公司Magnetic DNA Purification System For Food試劑盒提取，提取的過程注意防止交叉污染。

2.2?實時熒光PCR檢測

反應體系見表2。

擴增條件95℃ 10min;95℃ 1min，60℃ 30s（讀取熒光），40個循環。

2.3?實驗設置

每個實時熒光PCR反應均需要設置2個平行實驗，同時還應設置陽性對照、陰性對照和空白對照。陽性對照：實時熒光PCR反應體系中使用轉基因大豆GTS40-3-2提取的DNA為模板;陰性對照：實時熒光PCR反應體系中采用已知不含轉基因大豆GTS40-3-2的大豆DNA為模板;空白對照：實時熒光PCR反應體系中使用無菌雙蒸水代替DNA模板。

3?結果及分析

根據擴增結果，內源基因Lectin和外源基因pCaMV35S 、tNOS 、GTS40-3-2檢測結果均為陽性，空白對照、陽性對照和陰性對照均符合要求，判定該樣品含轉基因大豆GTS40-3-2成分。擴增圖見圖1至圖4。（結果為單次實驗結果，平行實驗結果相同）。

樣品1～8分別為：1號豆粕、2號豆粕、3號豆粕、4號豆粕、肉牛專用復合預混料、中豬預混料、產蛋雞飼料、通用型狗糧）。檢驗結果表明：僅8號樣品未檢出轉基因大豆GTS40-3-2成分，其余7個樣品均含有大豆GTS40-3-2成分。

4?結論與討論

目前對于轉基因大豆成分的檢測，最常采用的檢測方法就是PCR檢測方法，而實時熒光PCR檢測的優勢有很多：如靈敏度高、操作方便、檢測時間短等[4]。目前，實時熒光PCR TaqMan探針技術在植物基因鑒定、水產漁業等方面已經得到了很普遍的應用[8]。對8份市售飼料原料及產品進行檢測，檢測結果表明：4份豆粕中均檢出轉基因大豆GTS40-3-2成分，4份飼料中僅通用型狗糧未檢出轉基因大豆GTS40-3-2成分，其它3種飼料均含有轉基因大豆GTS40-3-2成分。本研究表明實時熒光PCR方法完全可以滿足飼料中轉基因大豆GTS40-3-2成分檢測要求，可以用來快速、準確地開展日常檢測工作。本研究在實驗過程中也發現飼料多經過高溫蒸煮、烘烤等生產工藝，因此提取的DNA模板的DNA濃度和純度不高，模板的濃度和純度對目的基因的檢測來說是較為重要的。建議在實驗過程中，利用紫外分光光度計測定模板DNA的濃度，并計算出A260 nm/A280 nm的比值，通常情況下，比值在1.7～2.0之間比較好。同時，在模板DNA質量滿意的情況下，建議實時熒光PCR反應體系中模板的添加量為50～100 ng。日常檢測數據顯示飼料中使用轉基因產品的比例很高，而我國對飼料及飼料原料中轉基因成分的使用管理力度不大，建議相關部門加強對轉基因產品的使用進行監管，保證含有轉基因產品的飼料合理、合法使用。

參考文獻

[1] 2018年全球生物技術/轉基因作物商業化發展態勢[J].中國生物工程雜志，2019，39（08）：1-6.

[2]王南，李海燕.轉基因大豆概況及其安全性[J].吉林農業，2016（19）：118.

[3]方獻平，馬華升，余紅，金亮，劉輝，張樂，翁麗萍，來文國.轉基因常見檢測技術與蛋白質組學的應用[J].浙江農業科學，2013（10）：1328-1330.

[4]孟靜，任易婕，孫瀟慧，鐘麗霞，霍勝楠.聚合酶鏈式反應方法檢測豆制品中轉基因成分的研究概述[J].中國釀造，2018，37（11）：22-25.

[5]石盼盼，王璐，郝麗花，謝文佳，等.大豆及其加工食品轉基因成分檢測技術研究進展[J].食品安全質量檢測學報，2019，10（10）：3166-3172.

[6]方慧，張昭，王海龍，楊向東，何勇，鮑一丹.基于中紅外光譜技術鑒別轉基因大豆的方法研究[J].光譜學與光譜分析，2017，37（03）：760-765.

[7]國家市場監督管理總局、中國國家標準化管理委員會. GB/T19495.4-2018 轉基因產品檢測 實時熒光定性聚合酶鏈式反應（PCR）檢測方法[S].中國標準出版社，2018.

[8]姜文燦，岳素文，江洪，等.TaqMan探針法實時熒光定量PCR的應用和研究進展[J].臨床檢驗雜志（電子版），2015，4（01）：797-805.

作者簡介：

劉彥泓（1976-），女，碩士，高級工程師。研究方向：分子生物學及微生物學檢驗。