分子標記輔助選育甘藍型油菜抗磺酰脲類除草劑恢復系

張超 胡茂龍 代文東 王軍 唐容 黃莎 楊克相 饒勇

摘?要：

選育抗磺酰脲類除草劑的甘藍型油菜波里馬細胞質雄性不育（polima cytoplasmic male sterility，pol CMS）恢復系，為培育抗除草劑pol CMS“三系”雜交種打下基礎。以甘藍型油菜pol CMS恢復系2350C為母本與抗磺酰脲類除草劑油菜M342雜交，利用苯磺隆除草劑在F2分離群體中篩選抗性單株，采用分子標記輔助選擇純合抗性植株并與pol CMS不育系測交，鑒定攜帶純合pol CMS恢復基因的單株，經過多代自交成功選育了抗除草劑的pol CMS恢復系18Z363，利用18Z363配制的抗除草劑pol CMS“三系”組合中有1個比對照品種油研50增產3.85%、2個組合與對照產量持平，表明該恢復系具有一定的配制高產組合的潛力。

關鍵詞：

甘藍型油菜;磺酰脲類除草劑;波里馬細胞質雄性不育;分子標記輔助選擇;苯磺隆

中圖分類號：S565.4

文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20191230014

油菜是重要的油料作物和經濟作物之一，在我國廣泛種植[1];油菜生產易受雙子葉闊葉類雜草侵害[2]，防治難度較大，油菜生產因草害造成的減產嚴重[3];此外，受我國經濟發展的影響，農村勞動力缺乏，人工除草增加了勞動力的投入，降低了油菜生產的效益，因此使用除草劑控制油菜田雜草優勢明顯。磺酰脲類除草劑具有毒性低、半衰期短、殘留少等優點，在防治闊葉類雜草中應用廣泛[4]，篩選、培育抗磺酰脲類除草劑的油菜品系已是當前油菜育種的重要目標之一[5]。波里馬細胞質雄性不育（polima cytoplasmic male sterility，pol CMS）是第1個有實用價值的油菜細胞質雄性不育類型，已被廣泛應用于油菜雜交種的配制[6]，而選育pol CMS恢復系是配制油菜“三系”品種的重要環節。因此，抗磺酰脲類除草劑的pol CMS恢復系的選育對培育抗除草劑油菜品種以解決我國油菜生產田間化學除草難題具有重要意義。磺酰脲類除草劑主要通過抑制植物乙酰乳酸合酶（Acetolactate synthase，ALS），使亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸等 3種支鏈氨基酸生物合成受阻，蛋白質合成停止，最終導致植株死亡[7]，利用ALS基因突變可以創制抗磺酰脲類除草劑的種質資源。在油菜中，加拿大學者率先報道了突變ALS基因獲得除草劑抗性材料[8];近年來，國內對ALS為靶向的抗除草劑油菜也開展了大量研究，高建芹等[9]在噴施除草劑的油菜-大豆輪作田里也發現了抗ALS抑制劑類除草劑的油菜自然突變資源M9，具有一定的實用價值;隨后江蘇省農科院經濟作物研究所采用EMS誘變油菜品系N131創制了多個抗除草劑的油菜資源[10， 11]。孫妍妍等[12]在篩選甘藍型油菜中雙9號EMS誘變庫時發現了抗苯磺隆的突變株，研究發現抗性植株ALS基因發生了突變，隨后研究者根據ALS基因突變位點成功設計了等位基因特異的引物，可以用來進行分子標記輔助選擇抗除草劑的轉育后代;Li等[13]在用苯磺隆進行油菜化學殺雄配制雜交種過程發現了1個ALS基因突變的抗苯磺隆材料，根據ALS突變位點開發的dCAPS標記與苯磺隆抗性共分離;Hu等[14]采用EMS誘變獲得了具有實用價值的抗磺酰脲類除草劑油菜資源M342，隨后程麗等[15]等根據M342的ALS突變基因設計了CAPS標記，在M342與不抗材料雜交后代分離群體中驗證發現該標記可以有效區分純合抗性、雜合抗性和純合不抗除草劑的單株;這些研究為采用分子標記輔助轉育抗磺酰脲類除草劑材料提供了重要參考。Pol CMS恢復系是配制pol CMS“三系”品種的關鍵，研究認為油菜的pol CMS恢復基因是1對顯性主效基因[16]，可通過雜交來進行恢復基因的轉移，通過與pol CMS不育系的測恢來篩選攜帶純合恢復基因轉育單株[17]，以創制不同遺傳背景的恢復系。

本研究利用M342為抗磺酰脲類除草劑基因來源，采用分子標記輔助選擇，結合苯磺隆抗性鑒定、pol CMS測恢鑒定，快速獲得抗磺酰脲類除草劑的pol CMS恢復系，減少了工作量，加速了轉育進程。

1?材料與方法

1.1?供試材料和試劑

1.1.1?實驗材料

甘藍型油菜抗磺酰脲類除草劑種質M342[14]由江蘇省農業科學院經濟作物研究所提供;pol CMS恢復系2350C[17]及pol CMS不育系J068A 、LDX370A、LDX374A、LDX380A、LDX414A、LDX422A、LDX6-18A、LDX82-11A、LDX92-11A、LDX95-58A、常規03A由貴州省農業科學院貴州省油料研究所提供;組合比較對照品種油研50（CK）由貴州省油菜研究所提供。

1.1.2?實驗試劑

Ex Taq、dNTP、DNA Marker等購自寶生物工程（大連）有限公司;Gold View核酸染料、瓊脂糖購自北京索萊寶科技有限公司;BsrD I（New England Biolabs）購自NEB（北京）;苯磺隆（有效成分10%，可濕性粉劑）購自安徽省圣丹生物化工有限公司;引物合成委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2?DNA提取及除草劑抗性基因的分子標記檢測

采用CTAB法提取甘藍型油菜轉育后代單株的葉片基因組DNA[18]，用于分子標記輔助選擇;DNA提取后采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用Nanodrop2000測定濃度;利用程麗等[15]公布的引物（M342 F：5-GTTTGCGAGCAGGGCTAAGA-3，M342 R：5-GACATCCAACAGGTACGGTCCA-3）和方法進行抗磺酰脲類除草劑基因的轉育跟蹤：采用M342F+M342R引物用Ex Taq 進行PCR擴增，PCR產物用BsrD I限制性內切酶酶切，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，攜帶純合除草劑抗性基因的單株電泳產物為766bp單一條帶，攜帶雜合除草劑抗性基因的單株電泳產物為766bp、570bp、196bp 3條條帶，而不抗除草劑單株為570bp、196bp 2條條帶。

1.3?實驗材料田間種植

F2分離群體種植：按2m寬、10m長廂面均勻撒播，3～6葉期噴施苯磺隆，噴施14d后選抗性單株按行長2m、行距40cm、株距25cm移栽。轉育后代自交材料田間種植：行長2m、行距40cm、每行按穴距25cm小穴點播3～5粒油菜種子，3～6葉期定苗，每穴留苗1株。測恢組合種植：行長2m、行距40cm、每行按穴距25cm小穴點播3～5粒油菜種子，不勻苗，花期調查育性。pol CMS“三系”組合鑒定試驗：設置5行1小區，隨機區組排列，3次重復，對照品種為油研50;行長2m、行距40cm、每行按穴距25cm小穴點播3～5粒油菜種子，3～6葉期定苗，每穴留苗1株。

1.4?苯磺隆田間鑒定油菜除草劑抗性

幼苗3～6葉期，用苯磺隆（有效成分10%，可濕性粉劑）稀釋成400mg/L工作藥液，按18 g.a.i/hm2的用量噴施，14d后調查死亡情況和受抑制情況。

1.5?抗除草劑pol CMS恢復系選育過程

2015年春選健壯的pol CMS恢復系2350C單株做母本，以M342為父本，人工去雄配制雜交組合，成熟后收獲F1雜交種，并于2015年5月種植于貴州省威寧縣麻乍鎮（緯度：N 26°64′，經度：E 104°09′，海拔：2223.50m），套袋自交并于2015年9月底收獲自交種。2015年9月底在貴州省油料研究所貴陽試驗地種植F2分離群體，于2015年11月中旬幼苗3～6葉期噴施苯磺隆除草劑，不攜帶抗性基因的單株死亡淘汰;選擇健壯的存活單株用M342F+M342R引物進行分子標記輔助選擇，保留攜帶純合除草劑抗性基因的單株，在2016年春季花期套袋自交，并按單株取花粉與pol CMS不育系LDX95-58A進行測交。2016年5月收獲單株自交種及測交組合到威寧進行夏繁，開花期調查測交組合的育性，淘汰部分植株不育、全不育及恢復度差的測交組合所對應的F2單株，選全可育組合對應的F2單株后代套袋自交。2016年9月收獲自交種后進行品質分析，篩選“雙低”單株繼續種植并套袋自交、夏繁、品質分析，至F7代選整齊穩定株系18Z363與pol CMS不育系測交及組合配制，2018年9月種植18Z363的F8株系及配制組合，進行苯磺隆除草劑抗性鑒定及花期恢復性調查，確定18Z363為新選育的抗磺酰脲類除草劑pol CMS恢復系。

1.6?農藝性狀調查

成熟期，自交系、組合比較試驗各小區隨機取10株，采用常規方法考察株高、一次有效分枝高度、一次有效分枝數、主花序長、主花序角果數、單株有效角果數，每株取1次分枝中部30個角果計算每角果粒數，單株脫粒測量單株籽粒產量并測量千粒重;采用FOSS NIR System近紅外分析儀（美國）進行品質分析;考種取樣后按小區收獲并測量小區產量。

1.7?數據處理

用Excel2013匯總整理數據，采用SPSS22.0軟件對數據進行統計分析。

2?結果與分析

2.1?分子標記輔助選擇選育抗除草劑pol CMS恢復系18Z363

用2350C與M342配制雜交組合，經夏繁加代獲得F2分離群體，噴施苯磺隆后從F2分離群體中鑒定出抗除草劑單株213株，按單株提取葉片DNA，采用M342F+M342R引物進行PCR擴增，擴增產物用BsrD I酶酶切后經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測可見（圖1）：抗苯磺隆除草劑材料M342僅在766bp處有特征條帶，pol CMS恢復系2350C和不育系LDX95-58A為不抗除草劑材料，電泳顯示有570bp、196bp 2條條帶（圖1B），而2350C與M342配制的F1帶型為766bp、570bp、196bp 3條條帶（圖1A），表明攜帶純合除草劑抗性基因的植株表現為僅在766bp處有1條特征條帶，攜帶雜合除草劑抗性基因帶型為766bp、570bp、196bp 3條條帶。根據分子標記的帶型從F2抗除草劑單株中挑選出攜帶純合除草劑抗性基因單株67株，于2016年春套袋自交并按單株與pol CMS不育系LDX95-58A測交。

2016年5月收獲67份單株自交種和測交組合進行夏繁，于盛花期鑒定測交組合的育性恢復情況發現，67份測交組合中有27個全不育、18個有不育/可育株分離、22個全可育，選擇22個全可育組合所對應的F2單株后代套袋自交，收獲自交種113份，品質分析篩選獲得芥酸<1%、硫甙<40μmoL/g、含油量>40%的單株17份，2016年10月種植篩選的17個單株自交種，衍生成17個株系并按生育期稍早、一次分枝多、株型緊湊、株高適中、芥酸<1%、硫甙<40μmoL/g、含油量>40%等標準定向選育到F7代，選擇綜合性狀優良的株系18Z363與pol CMS不育系配制組合，發現該株系對pol CMS為全恢;噴施苯磺隆除草劑鑒定發現18Z363和抗磺酰脲類除草劑材料M342能夠正常生長，而不抗除草劑材料2350C葉片發紅、發黃，逐漸死亡，表明抗磺酰脲類除草劑pol CMS恢復系18Z363選育成功。

2.2?18Z363的主要農藝性狀

2019年5月初油菜成熟期，考察18Z363及親本2350C、M342的農藝性狀可見（表1），選育的18Z363株高、主花序長度、含油量及芥酸含量等性狀與親本2350C、M342差異不顯著;18Z363的分枝高度、一次有效分枝數及單株角果數介于兩親本之間;18Z363的主序角果數、主序結角密度、每角粒數及千粒重接近親本2350C，而硫代含量及單株產量接近親本M342;此外，經過生育期的多代定向選擇，18Z363的生育期為220d，長于2350C的213 d，短于M342的335 d。這些結果表明18Z363綜合了親本2350C、M342的部分優良農藝性狀。

2.3?抗除草劑pol CMS恢復系18Z363的組合配制

用18Z363與貴州省農業科學院貴州省油料研究所選育的11個優良pol CMS不育系配制組合，苗期除草劑鑒定發現所有組合噴施苯磺隆除草劑后能夠存活，而對照品種油研50噴藥后14 d葉片發黃，逐漸死亡。采用分子標記鑒定可見18Z363在766bp處有特征條帶，說明18Z363攜帶純合的除草劑抗性基因（圖2A），而油研50及不育系顯示為570bp、196bp 2條帶，表明其不攜帶除草劑抗性基因;采用18Z363與11個優良pol CMS不育系配制的組合有766bp、570bp及196bp 3條帶，說明這些組合攜帶雜合的除草劑抗性基因（圖2B）。

成熟期考種發現（表2）：18Z363與J068A配制的組合小區產量最高，達到1.08±0.01kg/小區，比對照品種油研50增產3.85%，18Z363與LDX380A、LDX6-18A配制的組合產量與油研50基本持平，而18Z363與其他不育系配制的組合產量都顯著低于對照油研50，可見恢復系18Z363在配制優勢雜交組合上具有一定的潛力;18Z363配制的11個組合與對照品種油研50的農藝性狀考察發現，高產組合J068A×18Z363、LDX380A×18Z363、LDX6-18A×18Z363及對照油研50的一次分枝數、主花序較長、主花序角果數、單株角果數、每角粒數及單株籽粒產量等性狀不同程度地高于低產組合LDX92-11A×18Z363、LDX374A×18Z363、LDX82-11A×18Z363。

3?討論

利用除草劑進行油菜田的雜草防治，可以減少人工除草的勞動力投入，提高油菜生產效益。由于我國尚未批準轉基因抗除草劑油菜品系的生產種植，導致我國抗除草劑種質資源有限，近年來油菜抗除草劑種質創新已經成為油菜育種的重要目標之一[9-14]，但目前可用于生產的非轉基因抗除草劑油菜雜交品種鮮有報道，因此，選育抗除草劑pol CMS恢復系對培育抗除草劑pol CMS“三系”品種具有重要的意義。

M342為江蘇省農業科學院經濟作物研究所采用EMS誘變獲得的抗磺酰脲類除草劑種質資源，其BnALS3基因序列發生了單堿基突變，第574處的氨基酸由Trp突變成Leu，導致M342具有較強的磺酰脲類除草劑抗性，且該突變基因遵循1對顯性基因的遺傳模式[14];研究表明，pol CMS恢復基因也為1對主效顯性基因[16];因此，采用雜交轉育的方法聚合M342中的抗除草劑基因及pol CMS恢復系中的恢復基因在理論上僅有1/16的概率，選育過程工作量較大。利用M342來源的抗除草劑基因為顯性基因的特性，本研究在F2分離群體對單株進行苯磺隆除草劑處理，殺死不抗除草劑單株，縮小了選育范圍;此外，利用M342選育單位開發的分子標記[15]，對213個F2抗除草劑單株進行了標記輔助選擇，獲得了純合抗性單株67株，大大減少了選育的田間工作量。在pol CMS恢復系選育中往往對穩定自交后代測恢以篩選攜帶純合恢復基因的單株[17]，但這種方法需要較大的自交后代群體，具有一定的隨機性，而本研究在F2代就對單株進行測恢，可以提前篩選攜帶純合pol CMS恢復基因的單株，具有較強的目標性。采用這套方法，成功選育了抗除草劑的pol CMS恢復系18Z363，表明該方法可以為選育其它遺傳背景的抗除草劑pol CMS恢復系提供參考。

雜交轉育是作物遺傳育種的基本方法，可以利用具有不同性狀的親本配制雜交組合，在分離后代中定向選育，實現不同性狀的聚合[17]。本研究選育的18Z363實現了pol CMS恢復基因與除草劑抗性基因的聚合，其它農藝性狀調查發現18Z363遺傳了2350C的主序角果數多、主序結角密度高、單株有效角果數多等優點。由于親本M342來自長江下游油菜生產區，其生育期較長，不適合貴州地區的生態環境，而選育的18Z363的生育期相對于M342有所縮短，表明本研究在18Z363的選育過程中對早熟性進行定向選育有一定的效果。18Z363的每角粒數和千粒重性狀接近母本2350C而顯著低于M342，楊玉花等[19]研究認為油菜角粒數受母體效應影響較大，因此18Z363的每角粒數較低可能是由母本2350C的角粒數較低造成的;甘藍型油菜千粒重性狀同時受到基因的加性效應和顯性效應共同作用，以加性遺傳效應為主[20]，選育高千粒重材料需要利用高千粒重品種（系）做雜交親本， 利用主基因和多基因的加性效應來選育高千粒重后代[21]，可見千粒重改良比較復雜，需要系統的定向選擇，而本研究在18Z363的選育過程中重點關注了其除草劑抗性及pol CMS的恢復性，未為對其千粒重性狀進行系統選擇，導致其千粒重沒有提高。

采用18Z363與本單位選育的pol CMS不育系配制了11個組合，噴施苯磺隆除草劑鑒定發現11個雜交組合表現為抗除草劑，表明可以利用該恢復系培育抗除草劑的品種。組合產量鑒定發現11個組合中有1個組合的產量顯著高于油研50，2個組合與油研50產量持平，而油研50是貴州省審定和國家審定品種，具有較好的豐產性[22]，可見18Z363在配制高產組合中具有一定的潛力。對組合的農藝性狀調查發現高產組合（J068A×18Z363、LDX380A×18Z363、LDX6-18A×18Z363）及油研50的一次分枝數、主花序較長、主花序角果數、單株角果數、每角粒數及單株籽粒產量等性狀不同程度地高于低產組合（LDX92-11A×18Z363、LDX374A×18Z363、LDX82-11A×18Z363），表明在選育恢復系時應著重選育一次分枝數、主花序較長、主花序角果數、單株角果數、每角粒數及單株籽粒產量等性狀配合力高的材料。

參考文獻

[1] 王漢中. 以新需求為導向的油菜產業發展戰略[J]. 中國油料作物學報， 2018， 40（5）： 613-617.

[2]?朱文達， 魏守輝， 張朝賢. 湖北省油菜田雜草種類組成及群落特征[J]. 中國油料作物學報， 2008， 30（1）： 100-105.

[3]?李揚漢. 中國雜草志[M]. 北京： 中國農業出版社， 1998.

[4]鄒月利， 陶波. 磺酰脲類除草劑的降解機制及代謝產物的研究進展[J]. 農藥科學與管理， 2011， 32（10）： 24-31.

[5]胡茂龍， 浦惠明， 張潔夫. 我國抗ALS類除草劑油菜種質創制與研究進展[J]. 中國油料作物學報， 2018， 40（5）： 679-686.

[6]Fu T D， Yang G S， Yang X N. Studies on three line Polima cytoplasmic male sterility developed in B. napus[J]. Plant Breeding， 1990， 104（2）： 115-120.

[7]?Binder S， Knill T， Schuster J. Branched-chain amino acid metabolism in higher plants[J]. Physiologia Plantarum， 2010， 129（1）： 68-78.

[8]Swanson E B， Herrgesell M J， Arnoldo M， et al. Microspore mutagenesis and selection： Canola plants with field tolerance to the imidazolinones[J]. Theoretical and Applied Genetics， 1989， 78（4）： 525-530.

[9]?高建芹， 浦惠明， 戚存扣， 等. 抗咪唑啉酮油菜種質的發現與鑒定[J]. 植物遺傳資源學報， 2010， 11（3）： 369-373.

[10]?浦惠明， 胡茂龍， 高建芹， 等. 一種基于ALS靶酶的抗除草劑油菜定向選育方法[P]. 201310054645. 9. 2013-05-01.

[11]胡茂龍， 浦惠明， 龍衛華， 等. 具有除草劑抗性的乙酰乳酸合酶突變蛋白及其應用[P]. 201710568511. 7. 2017-10-13.

[12]孫妍妍， 曲高平， 黃謙心， 等. 甘藍型油菜抗苯磺隆突變體ALS基因分析與SNP標記[J]. 中國油料作物學報， 2015， 37（5）： 589-595.

[13]Li H T， Li J J， Zhao B， et al. Generation and characterization of tribenuron-methyl herbicide-resistant rapeseed （Brasscia napus） for hybrid seed production using chemically induced male sterility[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2015， 128（1）： 107-118.

[14]?Hu M L， Pu H M， Gao J Q， et al. Inheritance and molecular characterization of resistance to AHAS inhibiting herbicides in rapeseed[J]. Journal of Integrative Agriculture， 2017， 16（11）： 2421-2433.

[15]?程麗， 胡茂龍， 浦惠明， 等. M342抗除草劑基因CAPS標記的開發與應用[J]. 江蘇農業學報， 2019， 35（2）： 241-247.

[16]?楊光圣， 傅廷棟， 馬朝芝， 等. 油菜波里馬細胞質雄性不育恢復基因的篩選與遺傳[J]. 1996， 29（4）： 17-22.

[17]?張超， 李大雄， 羅莉斯， 等. 甘藍型油菜雙低pol CMS恢復系2350C的選育與應用[J]. 貴州農業科學， 2014，42（10）： 15-17.

[18]Murray M G， Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J]. Nucleic Acids Research， 1980， 8（19）： 4321-4326.

[19]?楊玉花. 甘藍型油菜每角粒數遺傳結構和機制解析[D]. 中國農業科學院研究生院博士學位論文， 2016：26-32.

[20]?董育紅， 關周博， 韋世豪， 等. 甘藍型油菜千粒重的遺傳效應分析[J]. 作物研究， 2016， 30（5）：516-519.

[21]?戚存扣， 浦惠明， 張潔夫， 等. 油菜（Brassica napus L.）千粒重性狀主位點組遺傳分析[J]. 江蘇農業學報， 2005， 21（1）： 1-5.

[22]?張瑞茂， 陳大倫， 李敏， 等. 抗裂角優質高效雜交油菜品種油研50的選育[J]. 中國油料作物學報， 2013， 35（增刊）： 239-242.

作者簡介：

張超（1985-），男，碩士研究生，助理研究員。研究方向：油菜遺傳育種。