蒲公英水提物對小鼠應激性肝損傷的保護作用研究

王 萌， 王帥偉， 隋欣儒， 尹廣達， 范博銘， 張雪梅

(延邊大學農學院，吉林 延吉 133002)

大腸桿菌(Escherichiacoli)是一種典型的革蘭氏陰性無芽胞直桿菌，屬于豬體內的常駐菌，一旦機體免疫力下降或環境變化就會引起仔豬發病，豬大腸桿菌病在養殖業是危害嚴重的常見病和多發病，發病率已達到60%以上。豬源性大腸桿菌病具有流行性廣、發病率高、死亡率高的特點，長期以來給養豬業帶來了巨大的經濟損失。目前，細菌耐藥性導致的問題非常嚴重，尤其是大腸桿菌對抗菌藥物的耐藥性問題已在世界范圍內引起了重視[1]。由于耐藥菌株的產生，使得抗生素藥效降低。所以開發不易產生耐藥性、藥效強、成本低的新型藥物是未來防治大腸桿菌病的主要方向。

蒲公英(Dandelion)別名婆婆丁、蒲公草、黃花地丁等[2]。蒲公英作為一種傳統中藥,含有豐富的生物活性物質，包括甾醇、生物堿、萜類、糖蛋白、低聚糖等[3-4]。蒲公英具有清熱解毒、消腫散結、利濕、利尿通淋、保肝利膽等功效，現代藥理研究表明，其具有抗氧化、抗疲勞、抗菌和抗炎等多種作用[5-7]，且價格低廉、毒副作用小，被廣泛用于疔瘡腫痛、乳癰、眼痛目赤、肺癰、熱淋澀痛、急性乳腺炎、感冒等多種炎癥性疾病的治療。本試驗探討了蒲公英水提物對豬源大腸桿菌所引起的應激性肝損傷的保護作用和血清中炎性細胞因子的表達調節效果，為蒲公英藥物的進一步研發和畜禽大腸桿菌性疾病的防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

體重18～22 g昆明小鼠25只，8周齡，購自延邊大學實驗動物中心。

1.2 試驗菌株

豬源大腸桿菌分離株D4菌懸液，由延邊大學農學院動物醫學系藥理毒理實驗室在延邊某養殖場分離鑒定菌株。

1.3 蒲公英水提物

將藥店買來的蒲公英干草置于煎器中，加水浸沒藥材，浸泡適宜時間后，加熱至煮沸，保持微微沸騰一定時間，分離煎出液，藥渣依法煎出3次，至煎液味淡為止，合并3次煎出液，濃縮至規定濃度。

1.4 主要試劑

TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-4試劑盒均購于Biolegend 公司；GSH、SOD試劑盒均購于南京建成研究所。

1.5 試驗方法

1) 試驗動物分組與給藥

選25只小鼠，適應性飼養3 d后，隨機分為5組，每組5只，分別為空白組、模型組及蒲公英提取物低、中、高劑量組(2.5、5、10 g/kg)。蒲公英提取物高、中、低劑量組連續灌胃7 d，2次/d，空白組灌胃等體積生理鹽水。

2) 動物模型的建立

給藥7 d后，除空白組外，每組小鼠均腹腔注射豬源大腸桿菌分離株D4菌懸液1×109CFU/kg，空白組腹腔注射等體積滅菌生理鹽水。

3) 小鼠肝組織中GSH和SOD活性的測定

用勻漿器將肝臟制成勻漿，取上清液。根據GSH和SOD的試劑盒說明書，檢測小鼠肝臟中GSH和SOD的活性。

4) ELISA法測定細胞因子的含量

各組小鼠于接菌24 h后眼球取血，分離血清，嚴格按照ELISA說明書測定血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-4的含量。

5) 統計學分析

2 結果與分析

2.1 蒲公英水提物對應激性肝損傷小鼠肝組織勻漿GSH和SOD含量的影響

由表1,2可知，與空白組相比，模型組極顯著的降低了小鼠肝臟中GSH和 SOD的含量(P<0.01)。與模型組相比，蒲公英水提物高劑量組能極顯著提高GSH和SOD的活性(P<0.01)，中、低劑量組顯著增加了 GSH的活性(P<0.05)，中劑量組顯著增強了 SOD的活性(P<0.05)，而低劑量組對小鼠肝臟中SOD的活性增強無顯著性的差異(P>0.05)。結果表明：蒲公英水提物能以劑量依賴方式增強豬源性大腸桿菌所致應激性肝損傷小鼠肝臟中GSH和SOD的活性。

表1蒲公英水提物對小鼠肝組織勻漿GSH含量的影響

Table1EffectofdandelionextractonGSHcontentinliverhomogenateofmice

組別給藥劑量(g/kg)GSH (μmol/gptot)空白組—68.17±2.65模型組—51.70±2.46##蒲公英水提物低劑量組2.557.78±3.59*蒲公英水提物中劑量組560.68±2.82*蒲公英水提物高劑量組1074.23±3.79**

注：與空白組比較,##P<0.01；與模型組比較,*P<0.05，**P<0.01。

表2蒲公英水提物對小鼠肝組織勻漿SOD含量的影響

Table2EffectofdandelionextractonSODcontentinliverhomogenateofmice

組別給藥劑量(g/kg)SOD (U/mgprot)空白組—154.36±14.25模型組—64.01±11.68##蒲公英水提物低劑量組2.570.28±13.65蒲公英水提物中劑量組585.04±10.43*蒲公英水提物高劑量組10109.33±7.25**

注：與空白組比較,##P<0.01；與模型組比較,*P<0.05，**P<0.01。

2.2 蒲公英水提物對應激性肝損傷小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ和IL-4表達量的影響

由圖1 可知，相較于空白組，模型組血清中的TNF-α含量極顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，蒲公英水提物高、中劑量組極顯著抑制了血清中TNF-α的分泌(P<0.01)，但低劑量組無顯著差異(P>0.05)。結果表明：蒲公英水提物能通過劑量依賴方式明顯抑制豬源性大腸桿菌所致應激性肝損傷小鼠血清中TNF-α的分泌。

注：與空白組比較,##P<0.01；與模型組比較,*P<0.05，**P<0.01。

由圖2可知，相較于空白組，模型組血清中IL-6的含量極顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，蒲公英水提物高、中劑量組極顯著抑制了血清中IL-6的分泌(P<0.01)，但低劑量組無顯著差異(P>0.05)。結果表明：蒲公英水提物能劑量依賴性抑制豬源性大腸桿菌所致應激性肝損傷小鼠血清中IL-6的分泌。

注：與空白組比較,##P<0.01；與模型組比較,*P<0.05，**P<0.01。

由圖3可知，相較于空白組，模型組血清IL-1β中的含量極顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，蒲公英水提物高、中劑量組能極顯著抑制血清中IL-1β的分泌(P<0.01)，但低劑量組無顯著差異(P>0.05)。結果表明：蒲公英水提物能劑量依賴性抑制豬源性大腸桿菌所致應激性肝損傷小鼠血清中IL-1β的分泌。

注：與空白組比較,##P<0.01；與模型組比較,*P<0.05，**P<0.01。

由圖4可知，相較于空白組，模型組血清中IFN-γ的含量極顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，蒲公英水提物高、中劑量組能極顯著抑制血清中IFN-γ的分泌(P<0.01)，但低劑量組無顯著差異(P>0.05)。結果表明：蒲公英水提物能劑量依賴性抑制豬源性大腸桿菌所致應激性肝損傷小鼠血清中IFN-γ的分泌。

注：與空白組比較,##P<0.01；與模型組比較,*P<0.05，**P<0.01。

由圖5可知，相較于空白組，模型組血清中IL-4的含量極顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，蒲公英水提物高、中劑量組能極顯著抑制血清中IL-4的分泌(P<0.01)，但低劑量組無顯著差異(P>0.05)。結果表明：蒲公英水提物能劑量依賴性抑制豬源性大腸桿菌所致應激性肝損傷小鼠血清中IL-4的分泌。

注：與空白組比較,##P<0.01；與模型組比較,*P<0.05，**P<0.01。

3 討論與結論

據研究報道，蒲公英水煎劑具有廣譜的抑菌作用，對大腸桿菌、痢疾桿菌、白色葡萄球菌、肺炎桿菌等均有效，尤其對大腸桿菌有較強的抑菌活性且不易產生耐藥性[8-10]，可改善機體免疫抑制狀態，增強和調節機體免疫功能。前人研究表明，蒲公英可以調節動物血清中IL-2、IFN-γ、IL-4 的分泌量，減少炎癥反應，減輕氧化應激，使肝傷小鼠抗氧化能力升高而起到保肝作用[11-12]。蒲公英可拮抗內毒素所致的肝細胞溶酶體和線粒體的損傷，解除抗菌素作用后所釋放的內毒素導致的毒性作用。對急性肝損傷的大鼠有保護作用[13]。

TNF-α、IL-6 、IL-1β和IFN-γ是由一組單核巨噬細胞、內皮細胞產生的細胞因子，具有激活細胞分化 、增強細胞殺傷靶細胞促進吞噬功能，也是機體炎癥反應和一系列病理生理過程的重要炎癥介質[15]。IL-4是Th2分泌主要細胞因子介導體液免疫對TNF-α有明顯抑制作用[16]。小鼠血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-4在模型組中分泌量顯著升高，與模型組相比，蒲公英水提物高、中劑量組均能顯著抑制TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-4含量。由此可知，各濃度的蒲公英水提物均能提高激性肝損傷小鼠肝組織GSH、SOD活性，降低血清中相關炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-4的過量表達。

綜上可知，蒲公英水提物通過降低小鼠血清炎性因子的表達量及升高肝組織GSH和SOD活性，降低炎癥反應，提高肝臟抗氧化能力，從而對豬源性大腸桿菌所致應激性肝損傷的小鼠肝臟起到保護作用。在臨床上常用于清熱解毒，消腫散結，擅長于消散癰腫和疔瘡。