梵凈山野生百合種質資源遺傳多樣性ISSR研究

姚琦馥，王 婷，邱 嵐

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梵凈山野生百合種質資源遺傳多樣性ISSR研究

姚琦馥1，王 婷2，邱 嵐1

（1．銅仁學院 農林工程與規劃學院，貴州 銅仁 554300； 2．吉首大學 生物資源與環境科學學院，湖南 吉首 416000 ）

ISSR； 梵凈山； 野生百合； 遺傳多樣性

1． 引言

百合(e)是一類多年生鱗莖草本植物的總稱，隸屬于百合科()百合屬()[1]，是世界重要的觀賞花卉，具有重要的經濟價值，備受人們的喜愛[2]。我國具有豐富的野生百合資源[3]，但是目前破壞比較嚴重，瀕危種不斷增多，對野生百合資源的保護舉措也遠遠不及國外，因此有效開展我國野生百合資源的開發與保護工作已迫在眉睫[4]。

梵凈山位于貴州省東北部，是武陵山脈的主峰，已被評為國家級自然保護區，同時又是聯合國“人與生物圈保護區網”成員之一，其境內野生百合資源十分豐富，其中《貴州植物志》對其種類、形態、使用價值等有一定的記載[5]。近年來，我國野生植物種質資源的開發和利用越來越受到重視。遺傳多樣性的研究是種質資源利用的一個重要內容，一個物的遺傳多樣性越高，對環境變化的適應能力就越強，越容易擴展其分布范圍和開拓新的環境。目前，野生植物種質資源以開展遺傳多樣性研究為主要趨勢[6]，而百合屬植物遺傳多樣性的研究多集中在栽培品種上，對梵凈山野生動植物保護區的野生百合遺傳多樣性研究尚屬空白。因此，本文利用ISSR分子標記技術對梵凈山5個百合野生種質材料、以及5個對照百合種質材料的親緣關系進行研究[7-9]，對制定野生百合種質資源遺傳多樣性保護措施、合理開發利用百合種質資源以及指導百合新種質的創新和新品種選育具有重要意義，同時為進一步進行分子標記輔助育種、數量性狀定位和構建遺傳圖譜奠定基礎[10-11]。

2． 材料與方法

2.1． 材料

2.1.1．百合

本研究選用了5個梵凈山野生百合種質材料，分別為梵野1號、梵野2號、梵野3號、梵野4號、梵野5號；5個對照品種如表1所示。所有百合材料均由銅仁市農科所百合基地提供。每份材料選新鮮鱗莖置于封口袋中，并立即放入預裝干冰的保鮮盒中保存，用于DNA的提取。

表1 百合材料地理來源及花色

2.1.2．主要試劑

本研究所用試劑分別為dNTP、MgCl2、TaqDNA 聚合酶、10×Taq buffer、DL2000 DNA Marker等，均購自上海生工生物工程有限公司。ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學(UBC)公布的第九套引物序列和日本Masumi Yamaishi等人在百合研究中所采用的3AISSR引物序列，并由華大基因公司合成。

2.2．方法

2.2.1．百合總DNA的提取

采用陳名紅等[12]的CTAB法經改進提取基因組DNA，利用紫外分光光度計和0.8%瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA進行質量和濃度的檢測，稀釋樣品濃度至20ng/μL后分裝并貯于-20℃條件下備用。

2.2.2．PCR擴增

總體積為20uL，其中含1uL模板DNA（20 ng/uL），2 uL 10×PCR Buff，1.2 uL MgCl2(1.5 mmol/L)，1.6 uL dNTPs(0.2 mmol/L)，1uL引物(0.5 Umol/L)，0.5 uLDNA Taq聚合酶U(1U)。

PCR反應程序為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共40個循環，72 ℃延伸10 min。ISSR-PCR擴增產物以Marker DL 2000作為分子量標準，用含有Gold View的2%瓊脂糖凝膠于140 V恒壓電泳。電泳結束后用凝膠成像系統儀拍照保存。

2.2.3．數據處理與統計分析

ISSR是顯性標記，其判定的標準是：若一對引物產生的擴增產物電泳率一致，則這對條帶則被認為同源。按照擴增產物在相對遷移位置條帶的有無來進行統計，有帶記為“1”，無帶記為“0”，利用Excel電子表格構建二元數據矩陣。遺傳變異各項參數用Popgene 1.32軟件進行分析，其中包括多態位百分率（PPB）、Shannon多樣性信息指數（Ho，在物種水平上為Hsp，在居群水平上為Hpop）、Nei’s基因多樣度指數（H）、平均每個位點上的觀察等位基因數（Na）、平均每個位點的有效等位基因（Ne）；利用NTSYSpc2.1軟件進行數據處理，采用Nei（1987）方法計算遺傳相似系數（genetic similarity）GS=2 Nij/（Ni+Nj），式中Ni和Nj分別為i和j兩材料的總等位位點數，Nij為i和j 兩材料的共有等位位點數。遺傳距離（genetic distance）GD＝1-GS。利用GD值按非加權成對算術平均法（UPGMA）進行聚類分析，構建樹狀聚類圖。

3． 結果與分析

3.1． 引物篩選及ISSR-PCR擴增多態性分析

利用ISSR-PCR方法從80條通用引物中篩選出條帶清晰、多態性豐富、重復性好的16條ISSR引物（見表2），對10份供試百合種質材料進行PCR擴增，并對擴增結果進行電泳檢測。結果表明，16條隨機引物共擴增出96個清晰可重復的有效條帶，每條引物平均擴增6條帶，擴增片段大小在100~2000 bp之間。同時，不同材料ISSR多態性因引物不同而有所變化，其中，P12和P21擴增效果較差（都為3條），多態性相對較差，而3A31擴增效果最好，共擴增出9條帶紋，且多態性條紋9條；在總體96個位點的DNA片段條帶中，其中具有多態位點的有77個（見表2），其多態性位點百分率（PPB）為80.2%，表明供試材料間遺傳多樣性水平較高。

將梵凈山野生百合材種質材料和對照種質材料分為兩個居群，結果（見表3）顯示：5種梵凈山野生百合種質材料的平均有效等位基因（Ne）為1.5411，平均Nei’s基因多樣性指數（H）為0.2855，平均Shannon多樣性信息指數（Hpop）為0.4101；而5種對照百合相對應的參數均低于梵凈山野生百合，表明梵凈山野生百合的遺傳多樣性水平較對照百合高一些。

3.2． 遺傳距離分析

通過Nei-Li相似系數法對10份供試材料的遺傳相似系數（GS）進行了估算（表4），GS值在0.4565~0.913之間，表明遺傳多樣性較豐富；10份材料間遺傳距離GD在0.0870~0.5435之間，平均為0.3785，種質材料間的遺傳基礎相對狹窄，種間遺傳差異較小，種間遺傳分化程度較低。

表2 本研究所用的ISSR引物及位點多態性

3.3． 聚類分析

利用NTSYSpc2.1軟件中的SHAN程序進行UPGMA聚類，構建樹狀聚類圖（見圖1）。結果表明，所有材料被分為2大類：梵野1號，梵野2號，梵野3號、巴特斯替洛和川百合聚在一類中，梵野4號、觀賞百合1號、觀賞百合2號、梵野5號和索邦百合聚在一起。在第一類中，梵野2號和梵野3號最先聚在一起，且遺傳距離短，說明二者親緣關系較近，而梵野1號單獨聚為一類，與其他四個的親緣關系較遠；第二大類中，在遺傳相似系數0.68處，梵野4號和梵野5號單獨聚類，親緣關系相對較遠，這一結果與居群間的遺傳距離（或遺傳一致性）分析結果是一致的。

圖1 供試百合材料的UPGMA聚類圖

4． 討論

4.1． 野生百合種質資源的遺傳多樣性分析

與形態學標記相比，分子標記能直接反映基因組DNA 的遺傳變異信息，有助于了解種質資源之間的遺傳差異，對于種質資源的合理利用具有重要意義。結果表明，16條引物共擴增出96條帶，其中多態性條帶77條，多態性位點百分率高達80.2%，Nei’s 基因多樣性指數、Shannon’s 信息指數分別為0.2855和0.4101，說明百合種質資源具有較高的ISSR多態性，遺傳變異也較為豐富。

表3 供試百合的遺傳多樣性

表4 10份供試材料的遺傳距離

4.2． 百合種質資源的保護策略

基于ISSR標記分析了10份百合材料的親緣關系，品種間的遺傳基礎相對穩定，其中5種梵凈山野生百合種質材料間遺傳差異較小，這可能是由于本研究選用的野生百合材料都屬于當地野生種質資源，未經過特異的馴化和變異[12-13]。本研究收集到的5個梵凈山野生百合種質材料都可在梵凈山區域良好生長。因此，遷地保護是梵凈山野生百合資源保存的辦法之一。從遺傳多樣性的有效保護來說，遷地保護的價值是通過一個居群的遺傳多樣性應達到或至少接近物種水平上的遺傳多樣性體現出來的。充分重視居群內不同類型個體的遷地保護，并且在遷地栽培后加快對梵凈山野生百合的大規模繁育技術研究，加強對當地農戶的科普教育，防止濫采濫挖，以適當的開發利用促進對野生資源的就地保護[14]，使梵凈山百合保持較高水平的遺傳多樣性，降低該種變成瀕危物種的風險。

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Genetic Diversity of Wild Lily Germplasm Resources from Fanjing Mountains Based on ISSR

YAO Qifu1, WANG Ting2, QIU Lan1

( 1.College of Agroforestry Engineering and Planning, Tonren university, Tongren 554300, Guizhou, China; 2.College of Biology and Environmental Science, Jishou university, Jishou 416000, Hunan, China )

Using ISSR molecular marker method, with five kinds of wild lily in Fanjing Mountainain and five control lily varieties of wild lily germplasm resources, the genetic diversity analysis, using 16 random primers amplification out 96 clear repeatable stripe effectively, average each primer amplification bands 6, amplified fragment size between 100~2000 bp, of which 77 loci are polymorphic, the percentage polymorphism loci (PPB) was 80.2%, indicate that the genetic diversity among the germplasms level is higher. (2) the genetic similarity coefficient (GS) of 10 tested materials was estimated by nei-li similarity coefficient method. The GS value was between 0.4565 and 0.913, indicating that the genetic diversity was relatively rich. The genetic distance between the 10 materials was between 0.0870 and 0.5435, with an average of 0.3785. The genetic basis between the germplasm materials was relatively narrow, with small inter-species genetic differences and low inter-species genetic differentiation. (3) UPGMA clustering results showed that the wild lily no. 2 and wild lily no. 3 of Fanjing Mountain were closer than the other three wild lily no. 3 of Fanjing Mountain. This study provides reference for the protection, breeding and development of wild lily species in Fanjing Mountain.

2018-10-23

梵凈山野生百合遺傳多樣性的研究（銅仁市科研（2016）79號）。

姚琦馥(1986-)，女，山西人，碩士，講師，研究方向：植物遺傳育種。

S682.29

A

1673-9639 (2018) 12-0106-05

（責任編輯 謝 勇）（責任校對 楊凱旭）