蘇州市患病水生動物體內細菌的分離鑒定及藥敏試驗

馮永杰，孫振麗，宣引明，蔣 明，潘云生，張益明，龔葉平，薛仁宇，胡小龍，曹廣力，貢成良

(1.蘇州大學基礎醫學與生物科學學院，江蘇蘇州 215123；2.昆山市水產技術推廣站，江蘇蘇州 215300)

魚類的細菌性疾病是一類嚴重危害魚類健康的疾病，常造成水產養殖的嚴重損失，很多疾病的爆發能引起水生動物大面積的死亡。目前，發現的主要細菌性疾病有淡水魚出血性敗血癥、潰瘍病、爛鰓病、愛德華氏病等。水產養殖對象感染水生動物的細菌種類很多，不同細菌感染往往使患病魚呈現不同的癥狀，生產上的細菌性疾病往往表現出一病多癥、一癥多病，從而給細菌性疾病的防治帶來了極大的困難。

抗生素對水生動物細菌性疾病有良好的防治效果，自1945年磺胺藥成功應用于治療鱒癤瘡以來，土霉素、卡那霉素、氨芐青霉素、金霉素、強力霉素、恩諾沙星、呋喃唑酮、惡喹酸、四環素、新霉素等相繼在水產養殖中應用[1]。不同的細菌對不同的抗生素敏感性存在很大差異，由于生產上對細菌性病原沒有進行分離、鑒定，也沒有進行藥敏試驗，隨意選擇抗生素進行治療往往導致防治效果很不理想。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，細菌的耐藥性也不斷增強[2-3]，耐藥菌，尤其是多重耐藥菌的不斷增加[4]，給水生生物的細菌病的治療帶來極大的困難。

為了解蘇州市不同地區水生動物中致病菌的種類及耐藥性，指導生產上科學合理使用抗生素，我們對2014年6-10月從不同地區采集的患病中華鱉、蝦、河蟹及魚中分離的細菌通過16S rRNA基因序列對分離菌進行了鑒定，并在此基礎上，對分離菌進行了藥敏試驗，以此探明不同細菌對抗生素的敏感性是否存在明顯差異，為科學用藥提供方向。

1 材料與方法

1.1 病樣采集

2014年6月15日于蘇州市吳江區金家壩鎮采集的患病南美白對蝦(Cyprinuscarpio)；6月19日于蘇州常熟市采集的患病錦鯉(夏花)和草魚(Ctenopharyngodonidellus)；7月1日于蘇州吳中區采集的患病異育銀鯽(Carassiusaumtusgibelio)；7月11日、9月9日在蘇州昆山市張浦鎮采集的患病中華鱉(Pelodiscussinensis)；9月28日于昆山淀山湖鎮采集的患病異育銀鯽、周市鎮采集的青魚、千燈鎮采集的患病河蟹(Eriocheirsinensis)；10月22日于昆山淀山湖鎮采集的鳙(Aristichthysnobilis)。所有采集的患病水生動物均存活，且有明顯的癥狀。

1.2 細菌分離

首先對采集患病水生動物用75%的酒精體表消毒，在超凈工作臺中無菌解剖，取小塊肝臟或肝胰腺移入LB液體培養基，37 ℃震蕩培養12 h，取50 μL菌液用無菌水稀釋適當倍數后均勻涂布到LB固體培養基中，37 ℃培養12 h，挑取單菌落在新LB固體培養基中劃線純化培養，37 ℃培養12 h，挑取單菌落接種LB液體培養基，37 ℃震蕩培養12 h。

1.3 細菌基因組抽提、16S rRNA基因克隆與測序

取新鮮菌液50 μL，煮沸5 min，12 000 r/min離心2 min，取上清液用作模板，用16S rRNA基因的通用引物27F(5′-agagtttgatcctggctcag-3′)/1492R(5′-tacggttaccttgttacgactt-3′)進行PCR擴增。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)回收特異性擴增產物。回收產物連接到pMD18-T載體(TaKaRa公司)后，轉化大腸桿菌TG1感受態細胞，挑取單菌落，用質粒抽提試劑盒(AXYGEN公司)抽提質粒，酶切鑒定，取陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測序。

1.4 細菌鑒定

將測序獲得的16S rRNA基因序列用在線Blast程序(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行同源搜尋，根據所測序列與GenBank中已公開的細菌16S rRNA基因序列的相似性確定所分離細菌的分類地位。

1.5 藥敏試驗

1.5.1 紙片擴散法

取200 μL菌液(濃度為108cfu/mL)均勻涂布到LB固體培養基，然后用無菌鑷子將分別加有10 μL(10 mg/mL)的鏈霉素、恩諾沙星、強力霉素、慶大霉素硫酸鹽、甲砜霉素的濾紙片(直徑6 mm)緊貼在培養基表面，于37 ℃恒溫培養12 h，測量各藥敏紙片的抑菌圈直徑，同設無菌水對照。

1.5.2 倍比稀釋法

將12支無菌薄壁透明EP管排列一排，依次編號，向第1管加入1 mL LB培養基，其余管各加0.5 mL培養基，然后向第1管中加5 μL(25 mg/mL)抗生素混勻，從中取0.5 mL加到第2管中，混勻后取0.5 mL加到第3管中，依次倍比稀釋到第11管；從第11管中吸出0.5 mL棄去，第12管不加抗生素作對照。向12支EP管中各加2 μL濃度為108cfu/mL的細菌懸液。37 ℃培養12 h，觀察結果。將未觀察到待檢菌繁殖的最低藥物濃度定義為最低抑菌濃度。

1.5.3 細菌耐藥情況判定

參考動物源細菌藥敏試驗標準(CLSI，2013)，分別以敏、中敏和耐藥三種形式對細菌的MIC進行統計分析。

1.6 分離菌中的質粒抽提與電泳檢測

取1.5 mL新鮮液體培養的細菌懸液，按質粒抽提試劑盒(AXYGEN公司)說明書提取各分離細菌的質粒，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。回收具有多重抗性的細菌的高拷貝質粒，轉化大腸桿菌TG1，涂到帶有氨芐青霉素(0.1 mg/mL)的LB固體培養基中，37 ℃培養12 h，觀察轉化結果，并進一步從轉化子中抽提質粒進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 患病水生動物的癥狀

患病的南美白對蝦肝胰臟顏色變深，潰爛，體色失去原有的淡青色；患病錦鯉的皮膚發炎充血，在水中打圈游動；患病的草魚、青魚和鯽都有體表充血、鰭基充血的癥狀；患病的中華鱉行動緩慢；患病白鰱的體表充血，脫鱗，鰭基充血。

2.2 基于16S rRNA基因序列的分離細菌的鑒定

分離到的14種菌的16S rRNA基因序列在GenBank上的登錄號及與相應菌的16S rRNA基因序列的同源性如表1所示。

表1 不同患病水生動物中分離細菌的基本信息Tab.1 Basic information of bacteria isolated from aquatic animals with different diseases

注： 4，5，6，7，8號，分離于同一條魚體內；11，12，14號分離于同一地區的不同品種魚體內。

2.3 分離菌藥敏試驗

2.3.1 紙片擴散法藥敏試驗結果

選擇了鏈霉素、恩諾沙星、強力霉素、慶大霉素硫酸鹽、甲砜霉素的藥敏紙片對各分離菌進行了抗生素的敏感性試驗(表2)。結果顯示，不同分離細菌對不同抗生素的敏感程度有很大差異，來源不同的同種細菌對某些抗生素的敏感程度也存在一定差異。來源吳中區的4號菌(A.veronii)對慶大霉素的敏感程度高于來源昆山市淀山湖鎮的11、12和14號同種細菌(A.veronii)，也高于來源同條魚體內的另一種A.veronii即5號菌，而對恩諾沙星的敏感性低于5、11、14號菌。9號菌為嗜水氣單胞菌，10號菌為摩根氏菌屬均從中華鱉中分離獲得，9、10號菌對6種抗生素均表現出較強的的耐藥性。

表2 分離細菌對抗生素的紙片的抑菌圈直徑Tab.2 Results of the disk diffusion test for the isolated bacteria against antibiotics mm

注：濾紙片的直徑：6 mm，每片濾紙抗生素的含量為100 μg；1～14號細菌名稱對應于表1。

2.3.2 最低抑菌濃度測定結果

最低抑菌濃度測定結果顯示，最低抑菌濃度因抗生素種類和分離菌的不同而有很大差異(表3)，該結果所反映的各分離菌的耐藥性與紙片擴散法藥敏試驗的結果基本一致。硫酸鏈霉素對各分離菌的最低抑菌濃度均較高，說明硫酸鏈霉素不適宜用于水生動物細菌性疾病的防治；試驗中所選擇的抗生素對嗜水氣單胞菌(9號菌)、摩根氏菌屬(10號菌)的最低抑菌濃度均較高，說明這2種菌具有較強的多重耐藥性；4、5號菌為同一條魚中分離到的維氏氣單胞菌，慶大霉素對5號菌的最低抑菌濃度比4號菌的高64倍，而恩諾沙星對5號菌的最低抑菌濃度是4號菌的1/64；而來自同一地區不同病魚體中分離的同種細菌(11、12、14號菌)對抗生素的敏感性也存在一定的差異。

表3 不同抗生素對分離菌的最低抑菌濃度Tab.3 The minimum inhibitory concentration of different antibiotics to the isolated bacteria μg/mL

注“1～14號細菌名稱對應于表1。s：高敏，s-：中敏，r：耐藥。

14種細菌對5種抗生素的耐藥情況見表3。結果顯示：所有細菌對硫酸鏈霉素均表現為耐藥，9號菌為嗜水氣單胞菌，10號菌為摩根氏菌屬均從中華鱉中分離獲得，除9號菌對慶大霉素表現為高敏外，9號10號菌對其它抗生素均表現為耐藥。5種維氏氣單胞菌A.veronii(4、5、11、12和14號)對甲砜霉素、強力霉素均表現為高敏，5、12、14號菌對慶大霉素中敏，4號菌對慶大霉素高敏；5、11號菌對恩諾沙星表現為高敏，14號菌對恩諾沙星表現為中敏，4、12號菌對其耐藥。1號菌(不動桿菌屬)對恩諾沙星中敏，2、3號菌(黃桿菌屬)對試驗選擇的抗生素(除硫酸鏈霉素)均為高敏；除硫酸鏈霉素外，6號菌(弧菌)和7號菌(弧菌)對所試驗的抗生素均表現出高敏，8號菌(希瓦氏菌屬)和 13號菌(A.enteropelogenes)對所試驗的抗生素也均表現出高敏。

2.4 質粒檢測

2.4.1 質粒抽提

對分離菌進行了質粒抽提和電泳檢測，結果顯示(圖3，表5)，1、2、5、8～12菌中明顯存在質粒，其中1和10號菌可能存在分子量不同的多種質粒；同一種細菌中不同的分離株之間所含質粒的情況存在不同，例如同屬于A.veronii的4、5、11、12、14號菌，5、11、12號菌可明顯檢測到質粒，而4、14號菌則幾乎沒有檢測到。2株耐藥性較強的9號菌(嗜水氣單胞菌屬)和10號菌(摩根氏菌屬)均明顯存在質粒。

圖3 不同分離菌來源的質粒DNA檢測Fig.3 Detection of plasmid DNA extracted from the isolated bacteria

表4 不同分離菌的質粒檢測Tab.4 Detection of plasmid extracted from the different isolated bacteria

1～14號細菌名稱對應于表1。

2.4.2 質粒抗性檢測

將摩根氏菌屬中拷貝數較高的1.8 kb大小的質粒和嗜水氣單胞菌中6 kb的質粒轉化大腸桿菌TG1，涂到帶有氨芐青霉素的LB固體培養基中，前者可以觀察到轉化子，挑取轉化子培養，抽提質粒進行電泳檢測，其質粒的分子量與原質粒相同，而后者則未成功得到轉化子。說明1.8 kb大小的質粒可能與分離菌的氨芐青霉素抗性有關，而嗜水氣單胞菌中的6 kb大小的質粒可能與氨芐青霉素抗性無關。隨后將9號菌中的6 kb質粒回收，進行全長測序，結果得出6 141 bp的序列(GenBank登錄號：KR677378.1)，并對序列進行分析，并未發現抗性基因，可以推測9號菌中對抗生素的抗性與其6 kb質粒無關。

3 討論

目前，水生動物中主要分離到的病原菌有氣單胞菌屬的斑點氣單胞菌(Aeromomaspunctata)、溫和氣單胞菌(A.sobria)、嗜水氣單胞菌，假單胞菌屬的熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、白皮假單胞菌(P.dermoalba)、水型點狀假單胞菌(P.punctatafascitae)、類志賀鄰單胞菌(Plesimonasshigelloides)，弧菌屬的鰻弧菌(Vibrioanguillarum)、霍亂弧菌(V.cholerae)、創傷弧菌(V.vulnificus)等，這些細菌的感染引起水生動物發生多種細菌性疾病。在本研究中，我們從不同地區采集的患病南美白對蝦、河蟹、錦鯉、草魚、鯽、中華鱉、青魚和鳙中分離到不動桿菌、黃桿菌、氣單胞菌、弧菌、希瓦氏菌、嗜水氣單胞菌、摩根氏菌，由于這些細菌均是從患病的活的有癥狀的水生動物血液中分離獲得，引起蘇州地區養殖水生動物細菌性疾病的細菌種類較多。氣單胞菌的致病范圍十分廣泛，它可導致多種水產動物患病，引起大量死亡[5-6]。在本研究中，從患病魚類的血液中分離的細菌以氣單胞菌屬最多，推測引起蘇州地區養殖魚類細菌性疾病的主要流行菌為氣單胞菌屬的細菌。從同一條患病的鯽中可以同時分離到維氏氣單胞菌、弧菌和希瓦氏菌，表明魚類的細菌性疾病有時可以由多種細菌共同感染引起。

正確使用抗生素是防治水生動物細菌性疾病的有效方法，但是，不同種的細菌、同一種細菌的不同的分離株對抗生素的敏感性存在明顯差異，同時由于養殖生產上濫用抗生素，細菌的耐藥性增加，往往導致生產上使用抗生素的治療效果不令人滿意。9號嗜水氣單胞菌和10號摩氏摩根菌對所選擇的抗生素均表現出明顯的耐藥性，特別是摩氏摩根菌，對硫酸鏈霉素表現出極強的耐藥性，其最低抑菌濃度>125 μg/mL；從昆山不同患病魚(鯽、青魚、鳙)中分離的維氏氣單胞菌(11、12、14號菌)對恩諾沙星表現出不同的敏感性，來自青魚的維氏氣單胞菌(12號)對恩諾沙星的耐藥性分別比來自鯽(11號菌)、花鰱(14號菌)維氏氣單胞菌的高15和3倍，不同魚體來源的同一種細菌的耐藥性存在明顯不同；同一病魚中存在細菌種相同但抗性不同的菌株，提示在篩選抗生素時對從病魚中分離到同一種細菌需分別進行耐藥性檢測。本實驗中所分離菌對硫酸鏈霉素均表現出耐藥性，因此，硫酸鏈霉素不太適合用于蘇州市的水產養殖業中細菌病防治。通過藥敏試驗篩選合適的抗生素用于水生動物細菌性疾病的防治有重要作用，但是由于不同抗生素在魚體內代謝各不相同，往往有可能在體外對細菌有作用的抗生素在體內不一定能發揮治療作用，因此，在藥敏試驗的基礎上進一步進行藥代動力學分析，對指導養殖生產中抗生素類藥物的正確使用有重要指導作用。

抗菌藥物作用主要是通過干擾病原微生物的生理生化代謝過程產生抗菌作用。細菌產生耐藥性有多種機制，部分菌的耐藥性與菌體存在質粒有密切關系[7-8]，本研究的結果顯示，4、5、11、12和14號菌均為維氏氣單胞菌，但4和14號菌中沒有檢測到質粒，因此可以認為這二個菌的耐藥性與質粒無關；而5、11、12號菌中可檢測到明顯的質粒，且不同菌株之間的質粒種類和分子量存在不同，維氏氣單胞菌不同分離株的耐藥性差異是否與其帶有的質粒有關還需進一步分析。

摩氏摩根菌的多重耐藥性與其質粒含有抗性基因密切關聯，從摩氏摩根菌已分離到61 093 bp的R485(GenBank登錄號：NC_016036.1)、2683bp的pCGH69(GenBank登錄號：NC_021524.1)和 2 683 bp的pM60(GenBank登錄號：NC_023901.1)質粒，在R485質粒中具有與磺類藥物抗性相關的二氫蝶酸合酶基因，在pCGH69和pM60中均檢測到編碼喹諾酮類耐藥性蛋白的基因[9]。在本研究中，我們發現從中華鱉中分離到的摩氏摩根菌呈多重耐藥性，并從摩氏摩根菌中檢測到表觀分子量不同的4種質粒(表4)，將表觀分子量為1.8 kb的質粒轉化到大腸桿菌可使其獲得抗氨芐青霉素的性能，表明該質粒可賦予摩氏摩根菌獲得氨芐青霉素耐藥性。本研究從摩氏摩根菌分離到的其他質粒是否與耐藥性有關還需進一步探討。

嗜水氣單胞菌對多種抗生素呈現耐藥性，對不同的抗生素有不同的耐藥機制。已有報道，在對環丙沙星、慶大霉素以及妥布霉素多重耐藥的嗜水氣單胞菌菌株中，檢測出9 416 bp、4 361 bp 以及1 925 bp 3 種質粒[7-8]，在GenBank已登錄的從不同嗜水氣單胞菌分離到分子量不同的質粒有12種，其中質粒pRA3(GenBank登錄號：NC_010919；45 909 bp)中含有鏈霉素-3′-腺苷轉移酶基因，編碼氨基糖苷類抗生素抗性蛋白；pBRST7.6質粒(GenBank登錄號：EU925817.1；7 621 bp)中存在喹諾酮類耐藥性基因，而pRA1質粒(GenBank登錄號：NC_012885.1；143 963 bp)是一種IncA/C 多藥物抗性質粒，含有四環素抗性基因和四環素阻遏蛋白基因。 本研究從嗜水氣單胞菌(9號菌)檢測到一種約6 kb的質粒，質粒全序列測序結果(GenBank登錄號：KR677378.1)顯示，該質粒中不存在與抗生素耐藥性有關的基因序列，因此該嗜水氣單胞菌的多重耐藥性與質粒無關，有必要從細菌的基因組水平進一步深入研究。