壓力刺激對組織工程骨替代物構(gòu)建的促進(jìn)作用研究

呂蘭欣，顏曉慶，楊紅寧，韓 東，胡書群

(徐州醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生應(yīng)急研究所,徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急救中心,江蘇徐州221002)

0 引言

由于疾病、車禍、自然災(zāi)害等原因引起的大尺寸長骨缺損日益增多,其修復(fù)問題一直是困擾臨床治療的難題,組織工程概念的提出為這一問題的解決提供了可能［1］。經(jīng)過近四十年的發(fā)展,骨組織工程研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展,大量的可降解生物材料用于制備組織工程支架,其中聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid,PLGA)因其降解速率可調(diào)以及良好的生物相容性而獲得廣泛關(guān)注［2－4］。PLGA多孔支架具有高孔隙率和聯(lián)通性,有利于細(xì)胞長入以及營養(yǎng)物質(zhì)輸送,在骨組織工程中被大量研究［5－6］。 然而,目前大部分骨組織工程的體外實(shí)驗(yàn)都是靜態(tài)培養(yǎng),與體內(nèi)環(huán)境差異較大。 有研究［7－8］表明,動(dòng)態(tài)培養(yǎng)如壓力刺激等能夠模擬體內(nèi)環(huán)境,促進(jìn)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,加速骨再生。本研究將微流控法與顆粒瀝濾法相結(jié)合,制備PLGA多孔支架,與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)共培養(yǎng)于壓力型生物反應(yīng)器中,研究壓力刺激對共培養(yǎng)系統(tǒng)成骨作用的影響,進(jìn)一步的,將壓力刺激后的組織工程骨替代物植入雞尿囊胚模型中,觀察其成骨效果。

1 資料和方法

1.1 材料本實(shí)驗(yàn)所用hMSCs購自LONZA,HUVECs購自GIBCO；所用PLGA購自Sigma；細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑均購自 Hyclone；細(xì)胞培養(yǎng)耗材均購自NUNC；細(xì)胞示蹤染料PKH26購自Sigma；所用CCK-8試劑盒購自VICMED；羊抗人CD31一抗以及FITC標(biāo)記的驢抗羊二抗均購自Santa Cruz。

1.2 方法

1.2.1 PLGA多孔支架制備 PLGA多孔支架的制備參照以前發(fā)表的文章進(jìn)行［9］。簡單介紹如下,利用本實(shí)驗(yàn)室搭設(shè)的微流控設(shè)備制備直徑為300 μm左右的明膠微球,自組裝法獲得規(guī)則排列的具有蛋白石結(jié)構(gòu)的明膠微球模板；將10%wt/v的PLGA溶液傾注于規(guī)則排列的明膠微球模板上,－20℃速凍2 h后冷凍干燥過夜去除溶劑；45℃水浴中攪拌過夜去除明膠微球,獲得具有規(guī)則形貌的PLGA多孔支架。支架浸泡于70%的酒精中2 h轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái),用磷酸鹽緩沖液沖洗3次風(fēng)干備用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將第3代hMSCs離心5 min收集,用PKH26染色試劑盒對其進(jìn)行示蹤染色。具體步驟按說明書進(jìn)行,簡述如下：將收集的hMSCs用無血清培養(yǎng)基洗兩遍,按1∶1將PKH26染液與稀釋液C混合獲得染料工作液,將工作液按1∶250的濃度加入稀釋液C中與hMSCs混勻室溫孵育10 min。加入等體積血清終止染色,用PBS洗3次獲得熒光標(biāo)記的hMSCs,計(jì)數(shù)備用。

收集HUVECs,將兩種細(xì)胞按以下比例進(jìn)行混合,hMSCs∶HUVECs＝9 ∶1,以2×106/mL的濃度接種于PLGA多孔支架,進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng),獲得組織工程骨替代物。于接種后第1、3、7天用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞分布情況,第 3、5、7、9天用 CCK-8檢測細(xì)胞增殖情況。

1.2.3 壓力刺激 靜態(tài)培養(yǎng)10 d后,將支架-細(xì)胞復(fù)合物轉(zhuǎn)移至六孔板中,用專用的壓力型生物反應(yīng)器進(jìn)行刺激,刺激頻率為1 Hz,每次壓力刺激時(shí)間為1 h,每天進(jìn)行一次,共7 d。

動(dòng)態(tài)培養(yǎng)7 d后取部分樣品進(jìn)行檢測,micro-CT用來檢測支架-細(xì)胞復(fù)合物經(jīng)壓力刺激后的成骨情況,掃描過程按照說明書以及儀器配置的軟件進(jìn)行。首先,將PLGA多孔支架作為空白對照進(jìn)行掃描,分辨率為8 μm,確定鈣化閾值為190,PLGA支架閾值為110。然后將靜態(tài)培養(yǎng)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的支架-細(xì)胞復(fù)合物分別進(jìn)行掃描,選擇閾值190以上為鈣化區(qū)域,110以下為PLGA支架區(qū)域。

掃描完成后,立即將支架-細(xì)胞復(fù)合物取出進(jìn)行免疫熒光染色。4%多聚甲醛固定后用3%牛血清白蛋白封閉1 h,羊抗人CD31一抗稀釋100倍4℃孵育過夜,PBS洗2次后加FITC標(biāo)記的驢抗羊二抗進(jìn)行室溫孵育2 h,最后加入DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色,用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.4 CAM實(shí)驗(yàn) 將動(dòng)態(tài)培養(yǎng)7 d后的組織工程骨替代物植入雞尿囊胚模型(CAM)中,37℃孵育7 d,取出后用4%多聚甲醛固定30 min,用micro-CT來檢測壓力刺激后的支架-細(xì)胞復(fù)合物在模擬體內(nèi)環(huán)境中的成骨情況,掃描過程按照說明書以及儀器配置的軟件進(jìn)行,具體同上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,分析結(jié)果均以±s表示。統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)；兩組比較時(shí)采用Student'st-test,P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖及活性

2.1.1 細(xì)胞示蹤 圖1為PKH26染料對hMSCs進(jìn)行細(xì)胞膜染色示蹤結(jié)果,接種后第1、3、7天激光共聚焦顯微鏡觀察,可見紅色熒光顯著增多,hMSCs在觀察期增殖顯著,表明PLGA多孔支架具有較好的細(xì)胞相容性。

圖1 hMSCs接種于PLGA多孔支架后第1、3、7天激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果

2.1.2 細(xì)胞增殖 圖2為細(xì)胞接種后第3、5、7、9天CCK-8檢測結(jié)果,可見在相應(yīng)的檢測時(shí)間點(diǎn),吸光值逐漸增加,細(xì)胞增殖明顯,這一結(jié)果與細(xì)胞示蹤結(jié)果一致。

圖2 hMSCs/HUVECs接種于 PLGA 多孔支架第 3、5、7、9天CCK-8檢測結(jié)果

2.2 壓力刺激對骨替代物構(gòu)建的作用

2.2.1 PLGA多孔支架鈣沉積 為檢測壓力刺激對細(xì)胞-支架復(fù)合物成骨的影響,在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)1周后進(jìn)行了micro-CT檢測。圖3為micro-CT檢測細(xì)胞-支架復(fù)合物在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)1周后的鈣沉積情況。其中圖3A為細(xì)胞-支架復(fù)合物靜態(tài)培養(yǎng),可見紅色區(qū)域接近于0,表明hMSCs幾乎沒有成骨分化；而圖3B為動(dòng)態(tài)培養(yǎng),可見有較為明顯的紅色區(qū)域,表明接種于PLGA多孔支架的hMSCs在壓力刺激下可以向成骨細(xì)胞分化,并且在2周左右即出現(xiàn)明顯鈣沉積。

圖3 Micro-CT檢測PLGA多孔支架接種hMSCs并經(jīng)壓力刺激一周后的鈣沉積情況

2.2.2 血管化 為檢測壓力刺激對細(xì)胞-支架復(fù)合物成血管的影響,在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)1周后進(jìn)行了CD31染色。圖4為細(xì)胞-支架復(fù)合物動(dòng)態(tài)培養(yǎng)1周后CD31免疫熒光染色結(jié)果,其中圖4A1～A4為靜態(tài)培養(yǎng)組,圖4B1～B4為動(dòng)態(tài)培養(yǎng)組。由CD31綠色熒光染色可見,兩組之間并沒有顯著差異,表明壓力刺激對血管生成沒有顯著作用。

圖4 細(xì)胞-支架復(fù)合物在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)1周后CD31免疫熒光染色結(jié)果

2.2.3 CAM培養(yǎng)后的鈣沉積 為模擬體內(nèi)環(huán)境,制備了CAM模型,將靜態(tài)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的細(xì)胞-支架復(fù)合物植入其中,培養(yǎng)7 d后對其鈣沉積狀況進(jìn)行了檢測。由圖可見在CAM模型中細(xì)胞-支架復(fù)合物的鈣沉積情況明顯優(yōu)于體外培養(yǎng)組,并且壓力刺激組鈣沉積顯著優(yōu)于靜態(tài)培養(yǎng)組(圖5)。這一結(jié)果表明在模擬體內(nèi)環(huán)境中,壓力刺激能夠顯著提高細(xì)胞-支架復(fù)合物的鈣沉積。

圖5 細(xì)胞-支架復(fù)合物在CAM模型中培養(yǎng)7 d后檢測鈣沉積結(jié)果

3 討論

骨組織工程研究為大片段骨缺損修復(fù)提供了可能。目前骨組織工程研究主要集中在骨組織工程支架設(shè)計(jì)以及誘導(dǎo)因子緩釋上,在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化以及體內(nèi)誘導(dǎo)骨再生方面取得了良好進(jìn)展［10－12］。 在骨組織工程支架材料選取上,很多生物材料因其組織相容性好以及可降解特性被廣泛關(guān)注,如PLGA、聚氨酯類(PHA)等；在支架設(shè)計(jì)上,多孔支架因?yàn)榫哂泻芎玫目紫堵屎吐?lián)通性,有利于氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸,有利于細(xì)胞和組織長入而被廣泛關(guān)注和研究［13－16］。 多孔支架的制備方法很多,如鹽顆粒瀝濾、冷凍干燥、相分離等,其中研究［1,17－18］報(bào)道的明膠微球?yàn)r濾法可以獲得孔徑十分均一,且聯(lián)通性極佳的多孔支架,并且不會(huì)因鹽顆粒的殘留影響后續(xù)研究,是一種有良好應(yīng)用前景的骨組織工程支架制備方法。本研究采用微流控裝置收集了直徑300 μm左右(304.5±12.7 μm)的明膠微球,將其整齊排列成各微球間緊密連接的三維模板,采用溶劑流延顆粒瀝濾法獲得PLGA多孔支架,孔隙聯(lián)通性接近100%,孔徑大小適宜且均一性好,有報(bào)道［9］稱此尺寸的孔徑有利于血管長入以及快速成骨。PLGA是一種FDA認(rèn)證的生物材料,具有良好的相容性,降解速率可調(diào),被廣泛應(yīng)用于骨組織工程研究中。本研究通過細(xì)胞示蹤技術(shù)以及細(xì)胞活性檢測也表明,PLGA多孔支架具有很好的細(xì)胞相容性,hMSCs與HUVECs聯(lián)合種植于PLGA多孔支架可以獲得細(xì)胞-支架復(fù)合物。

雖然目前骨組織工程研究很多,但大部分都是直接將支架與細(xì)胞結(jié)合植入體內(nèi)研究其成骨效果,其成骨速度較慢［3］。 有研究［7］聚焦于快速成骨,探討了壓力刺激對于成骨的促進(jìn)作用。各種生物反應(yīng)器也用于研究組織工程骨替代物的構(gòu)建,加速骨缺損的修復(fù),如灌注型生物反應(yīng)器(perfusion-based bioreactor systems)、旋轉(zhuǎn)型生物反應(yīng)器(spinner flask bioreactor,rotating bioreactor systems)、壓力型生物反應(yīng)器(direct mechanical strain system)［19］。 本研究采用了壓力型生物反應(yīng)器對細(xì)胞-支架復(fù)合物進(jìn)行間歇性壓力刺激,結(jié)果表明與普通的靜態(tài)培養(yǎng)法相比,該方法可以有效提高h(yuǎn)MSCs的成骨能力；進(jìn)一步通過CAM模型來模擬體內(nèi)環(huán)境進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)壓力刺激后的細(xì)胞-支架復(fù)合物能夠產(chǎn)生更多的鈣沉積,這也表明壓力刺激可以有效提高組織工程骨替代物構(gòu)建的速度,預(yù)示著壓力刺激后的骨組織工程替代物在植入體內(nèi)后能夠更快地成骨,縮短骨缺損修復(fù)的時(shí)間。Reinwald等［20］報(bào)道壓力刺激作用下,人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)于靜電紡絲納米纖維基底,成骨標(biāo)志物Ⅰ型膠原、堿性磷酸酶,以及Runx2均顯著上調(diào)。這與本研究結(jié)果相一致。

血管化情況對于骨組織工程替代物能否有效促進(jìn)骨缺損修復(fù)有重要參考價(jià)值,因?yàn)檠荛L入后可以將氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸至多孔支架內(nèi)部,會(huì)加快骨再生速度［21］。有很多血管生長因子被引入骨組織工程支架中以期達(dá)到促血管新生的目的［22－23］。 有研究［4,24］將內(nèi)皮細(xì)胞與干細(xì)胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞可以促進(jìn)干細(xì)胞表達(dá)新生血管標(biāo)志物CD31。本研究通過將hMSCs與HUVECs共培養(yǎng)于PLGA多孔支架形成細(xì)胞-支架復(fù)合物,分別進(jìn)行動(dòng)態(tài)培養(yǎng)和靜態(tài)培養(yǎng)后進(jìn)行CD31染色,檢測復(fù)合物血管化情況,結(jié)果顯示靜態(tài)培養(yǎng)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)組CD31的表達(dá)均較高,但是二者之間并無明顯差異。這一結(jié)果表明,HUVECs與hMSCs共培養(yǎng)能夠提高CD31表達(dá),但壓力刺激對于血管化并無明顯助益。理論上血管生成是血液輸送的需求所驅(qū)動(dòng),研究［3］發(fā)現(xiàn),三維支架植入動(dòng)物體內(nèi)后新生血管可以長入支架內(nèi)部,本研究暫未發(fā)現(xiàn)壓力刺激對血管化的顯著作用,后續(xù)我們將進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來研究在有血液輸送需求的情況下動(dòng)態(tài)培養(yǎng)和靜態(tài)培養(yǎng)對于血管新生的作用差異。

綜上所述,本研究將hMSCs與HUVECs共培養(yǎng)于PLGA多孔支架形成細(xì)胞-支架復(fù)合物,通過體外培養(yǎng)及壓力刺激構(gòu)建了組織工程骨替代物,在模擬體內(nèi)環(huán)境的CAM模型中對其進(jìn)行培養(yǎng),可以實(shí)現(xiàn)快速骨化,是一種有潛在應(yīng)用前景的組織工程骨替代物。