模擬酸雨高溫脅迫對桂花品種 ‘杭州黃’抗氧化酶活性和非結(jié)構(gòu)性碳代謝的影響

王小東，汪俊宇，周歡歡，傅盧成，王 彬，張汝民，高 巖

（浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300）

葉綠素是光合作用中支持植物生長的必需物質(zhì)，也是各種環(huán)境脅迫對葉片功能和健康損害的敏感指標(biāo)［1-2］。酸雨直接通過破壞質(zhì)膜、降解葉綠素、破壞葉綠體超微結(jié)構(gòu)和使植物關(guān)鍵酶失活而抑制植物的生長發(fā)育［3］。 酸雨可使植物細(xì)胞中氫離子（H＋）濃度升高［4］， 引起過氧化氫（H2O2）和超氧陰離子自由基（O2·-）等活性氧（reactive oxygen species,ROS）的過度積累，高水平的ROS會對細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成包括脂質(zhì)過氧化在內(nèi)的顯著損害［5-6］。植物抗氧化系統(tǒng)，包括抗氧化酶和非酶抗氧化劑，是ROS的清除和細(xì)胞膜穩(wěn)定性的維持重要的防御機(jī)制［7］。其中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）是抗氧化的第1道防線，它催化超氧陰離子歧化生成過氧化氫和氧氣，過氧化氫酶（catalase,CAT）是公認(rèn)的第2道防線，能夠清除細(xì)胞中產(chǎn)生的過氧化氫［8］，過氧化物酶（peroxidase,POD）能在高濃度氧的情況下保持較高的氧化還原活性，保護(hù)細(xì)胞免受高濃度氧的傷害［9］。非結(jié)構(gòu)性碳水化合物（nonstructural carbohydrate,NSC）主要包括果糖、葡萄糖、蔗糖和淀粉等，是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和能量物質(zhì)［10］。李天紅等［11］對蘋果Malus domestica研究發(fā)現(xiàn)：適度水分脅迫處理使葉片和根系中蔗糖含量升高，淀粉含量顯著降低；BOLOURIMOGHADDAM等［12］研究認(rèn)為葡萄糖代謝可以通過清除ROS從而防止細(xì)胞程序性死亡。環(huán)境脅迫導(dǎo)致初級代謝紊亂，影響可溶性糖的積累。可溶性糖除了作為代謝物質(zhì)和能量來源外，還充當(dāng)信號分子，協(xié)調(diào)合成代謝和分解代謝過程，促進(jìn)植物生長發(fā)育。酸雨被認(rèn)為是一種世界性的污染物，尤其是在北歐、北美和中國。中國酸雨污染面積占國土面積的40%以上，強(qiáng)酸雨區(qū)（pH≤4.5）面積居世界三大酸雨區(qū)之首，其中長江以南地區(qū)已成為全球強(qiáng)酸雨中心［13-14］。長江中下游地區(qū)受副熱帶高壓影響，梅雨季節(jié)過后常常伴隨著高溫，導(dǎo)致該地區(qū)植物易遭受酸雨和高溫雙重脅迫。桂花品種 ‘杭州黃’Osmanthus fragrans‘Hangzhou Huang’是木犀科Oleaceae木犀屬Osmanthus的常綠喬木，是新培育的珍貴品種。為了研究‘杭州黃’對酸雨高溫雙重脅迫的響應(yīng)，模擬酸雨高溫脅迫對非結(jié)構(gòu)性碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)、ROS及抗氧化酶活性的影響，揭示 ‘杭州黃’抵御酸雨高溫脅迫的生理生化指標(biāo)響應(yīng)機(jī)制，以及 ‘杭州黃’抗酸雨高溫脅迫的適應(yīng)對策，同時為植物多樣性保護(hù)、園林植物合理利用及可持續(xù)發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2016年6月，將生長良好、長勢基本一致的2年生 ‘杭州黃’實生苗（購于浙江杭州畫境種業(yè)有限公司， 苗高約 50 cm）栽植于盛有培養(yǎng)土［V（泥炭）∶V（沙土）∶V（蛭石）=1∶2∶1， 干質(zhì)量為 1.5 kg］花盆中（φ=25 cm，h=30 cm），1株·盆－1，共計40盆。盆栽苗常規(guī)管理，光照條件為自然光，緩苗期間，用自來水進(jìn)行澆灌。充分緩苗1個月，再實施酸雨高溫處理。

1.2 試驗處理

選取盆栽苗40盆，隨機(jī)分為8組，其中4組用作酸雨處理，另4組酸雨處理后再進(jìn)行高溫處理。酸雨處理：母液根據(jù)浙江省杭州市臨安區(qū)酸雨監(jiān)測分析資料，按照酸雨中x［硫酸根離子（SO42－）］∶x［硝酸根離子（NO3－）］=4∶1（摩爾比）的比例配制。 設(shè)置 pH 5.6（對照）， pH 4.0， pH 3.0， pH 2.0 等 4 個處理梯度，酸雨噴施量根據(jù)臨安區(qū)月均降水量，5 d噴施1次，噴施5 mm·次－1，連續(xù)處理40 d。處理結(jié)束后，選取桂花枝條從上至下第3對完整的功能葉片，取樣3.0 g·盆-1（約10個葉片），一部分新鮮葉片立即用做光合色素的測定，另一部分樣品用液氮迅速冷凍后保存于－80℃超低溫冰箱中待測定。高溫處理：將對照組和每個酸雨處理后的苗木，放入人工氣候箱 （晝/夜為40℃/28℃，濕度為40%，光合光子照度為400.0 μmol·m－2·s－1）， 脅迫2 d。 將對照組進(jìn)行高溫脅迫作為高溫組， 其他作為酸雨高溫協(xié)同處理組。5盆·處理－1，每盆作為1個獨(dú)立實驗，共5次重復(fù)。

1.3 試驗方法

1.3.1 光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定 光合色素的測定參照ARNON［15］的方法并略作改進(jìn)，根據(jù)LICHTENTHALER［16］的方法分別計算。

1.3.2 ROS和丙二醛（MDA）質(zhì)量摩爾濃度的測定 O2·－測定參照李忠光等［17］的研究方法并稍作改進(jìn)。過氧化氫測定參照CHANDRA等［18］的方法并略作改進(jìn)。MDA測定參照HODGES等［19］的方法。

1.3.3 抗氧化酶活性的測定 酶液提取方法：稱取0.5 g冷凍樣品，用液氮磨碎，加入9.0 mL磷酸緩沖溶液（0.1 mol·L－1， pH 7.4）研磨成勻漿， 10 000×g離心 15 min（4℃）。 取上清液用于 SOD， POD 和 CAT活性的測定。SOD活性測定參照南京建成生物科技有限公司生產(chǎn)的A001-1型SOD試劑盒進(jìn)行測定和計算。CAT和POD活性測定參照KUMARI等［20］的方法。

1.3.4 非結(jié)構(gòu)性碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定 取植物材料0.5 g，用液氮磨碎，加入10.0 mL蒸餾水研磨成勻漿，100℃水浴10 min，冷卻，3 000 r·min－1離心5 min，上清液為可溶性糖提取液。向沉淀中加體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇沖洗1遍，加蒸餾水3.0 mL，攪拌均勻，放入沸水浴中糊化15 min。冷卻后，加入4.0 mL冷的9.2 mol·L－1高氯酸，攪拌，提取20 min后加蒸餾水至25.0 mL，混勻，離心10 min，上清液為淀粉提取液。蔗糖、果糖和葡萄糖參照南京建成生物科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測定和計算。淀粉采用蒽酮比色法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為5次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，利用Origin 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、圖表制作和統(tǒng)計分析，統(tǒng)計方法采用單因素方差分析（one way ANOVA）進(jìn)行Turkey多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸雨高溫脅迫對 ‘杭州黃’光合色素的影響

由表1看出：隨著酸雨強(qiáng)度的增加，葉綠素a（Chl a）質(zhì)量分?jǐn)?shù)，總?cè)~綠素（Chl t）質(zhì)量分?jǐn)?shù)和Chl a/b均呈降低趨勢，pH 2.0處理分別比對照降低了16.9%，16.0%和4.8%（P＜0.05）。高溫脅迫后，葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)，總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和Chl a/b分別比對照降低了12.4%，10.8%和7.7%（P＜0.05）。酸雨高溫協(xié)同脅迫后，葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)，總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和Chl a/b進(jìn)一步降低，pH 2.0時分別比對照降低了27.7%， 23.8%和 19.5%（P＜0.05）。

2.2 酸雨高溫脅迫對 ‘杭州黃’ROS和MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響

由表2可見：隨著酸雨強(qiáng)度的增加，過氧化氫和O2·－質(zhì)量摩爾濃度逐漸增加，在pH 2.0時分別比對照增加了94.5%和140.9%（P＜0.05）；MDA先增加后降低，pH 3.0時比對照增加了75.0%（P＜0.05）。高溫脅迫后，過氧化氫、O2·－和MDA質(zhì)量摩爾濃度分別比對照增加了87.3%，120.9%和75.8%（P＜0.05）。酸雨高溫協(xié)同脅迫后，隨著pH值的增加，過氧化氫質(zhì)量摩爾濃度呈先增加后降低的趨勢，在pH 3.0時達(dá)最大值，比對照增加了180.1%（P＜0.05）；O2·－和MDA質(zhì)量摩爾濃度呈上升趨勢，pH 2.0時分別比對照增加了158.3%和142.0%（P＜0.05）。

表1 酸雨高溫脅迫對 ‘杭州黃’光合色素的影響Table 1 Effects of acid rain and heat stress on pigment contents in leaves of Osmanthus fragrans ‘Hangzhou Huang’

表2 酸雨高溫脅迫對 ‘杭州黃’葉片ROS和MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響Table 2 Effects of acid rain and heat stress on ROS and MDA contents in leaves of O.fragrans ‘Hangzhou Huang’

2.3 酸雨高溫脅迫對 ‘杭州黃’抗氧化酶活性的影響

從圖1A可以看出：隨著酸雨強(qiáng)度的增加， ‘杭州黃’葉片的SOD活性先增加后降低，在pH 3.0時比對照增加了48.9%（P＜0.05），隨后略微降低。由圖1B和圖1C可知：POD和CAT活性隨酸雨脅迫強(qiáng)度加強(qiáng)均逐漸增加，pH 2.0處理分別比對照增長了79.6%和118.2%（P＜0.05）。高溫脅迫后SOD，CAT和POD活性分別比對照增加了54.5%，64.1%和43.8%（P＜0.05）。

圖1 酸雨高溫脅迫對 ‘杭州黃’葉片抗氧化酶活性的影響Figure 1 Effects of acid rain and heat stress on activity of antioxidant enzymes in leaves of O.fragrans ‘Hangzhou Huang’

酸雨高溫協(xié)同脅迫下，隨脅迫強(qiáng)度的增加，SOD和CAT活性呈先增加后降低趨勢，均在pH 4.0處理達(dá)最大值，分別比對照增加了60.3%和92.9%（P＜0.05）；POD活性仍逐漸增強(qiáng)，pH 2.0處理比對照增加了107.3%（P＜0.05），說明酸雨高溫脅迫后主要靠POD發(fā)揮抗氧化作用減少自由基對植物造成的傷害。

2.4 酸雨高溫脅迫對 ‘杭州黃’非結(jié)構(gòu)性碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖2可見： ‘杭州黃’葉片葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在酸雨脅迫后變化不顯著；高溫脅迫后，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對照降低了10.2%（P＜0.05）；酸雨高溫協(xié)同脅迫后，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著酸雨強(qiáng)度的增加而減小，pH 2.0處理比對照降低了22.4%（P＜0.05）。

果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著pH值的降低呈先升高后降低趨勢，pH 2.0處理較pH 4.0降低了18.6%（P＜0.05）；高溫脅迫后，果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對照降低了13.5%（P＜0.05）；酸雨高溫協(xié)同脅迫后，果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著酸雨強(qiáng)度的增加而減小，pH 2.0處理比對照降低了38.1%（P＜0.05）?？梢钥闯?，脅迫程度較輕時，果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較穩(wěn)定，重度脅迫后則顯著降低。

蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在pH 2.0脅迫后顯著降低，比對照減少了18.9%（P＜0.05）；高溫脅迫后，蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對照降低了13.8%（P＜0.05）；酸雨高溫協(xié)同脅迫后，蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著pH值的降低而減少，pH 2.0處理比對照降低了41.6%（P＜0.05）。由此可見，單一酸雨和高溫脅迫時，蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)降幅較低；隨著協(xié)同脅迫程度的加深，蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低。

淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨pH值的降低呈下降趨勢，pH 2.0處理比對照減少了26.8%（P＜0.05）；高溫脅迫后，淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對照降低了25.3%（P＜0.05）。酸雨高溫協(xié)同脅迫后，淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸減少，pH 2.0處理比對照降低了40.1%（P＜0.05）。

圖2 酸雨高溫脅迫對 ‘杭州黃’葉片非結(jié)構(gòu)性碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Figure 2 Effects of acid rain and heat stress on non-structural carbohydrate contents in leaves of Osmanthus fragrans ‘Hangzhou Huang’

3 討論與結(jié)論

植物葉片是捕獲轉(zhuǎn)換光能和制造有機(jī)物的最重要器官［21］，植物葉綠素含量變化直接影響其光合作用過程［22］。干旱［23］、高溫和酸雨［24］等非生物脅迫導(dǎo)致植物葉綠素減少。在酸雨pH≤3.5的環(huán)境條件下，龍眼Dimorcarpus longana ‘Wulongling’葉片總色素含量和Chl a/b均下降［25］。本研究結(jié)果顯示： ‘杭州黃’葉片葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)及Chl a/b在酸雨或高溫單一脅迫后均明顯下降，協(xié)同脅迫后進(jìn)一步降低，說明酸雨高溫脅迫導(dǎo)致葉片光合色素結(jié)構(gòu)破壞，影響植物光合作用能力，協(xié)同脅迫對葉綠素破壞更大。

植物受到傷害時會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS大量積累［26］，促進(jìn)膜脂過氧化作用加強(qiáng)，產(chǎn)生大量MDA，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜功能受損，質(zhì)膜透性增加［27］，因此MDA質(zhì)量摩爾濃度的高低可迅速反映出植物受逆境傷害的程度［28］。吳永波等［29］研究發(fā)現(xiàn)：高溫或干旱脅迫后構(gòu)樹Broussonetia papyrifera幼苗ROS和MDA質(zhì)量摩爾濃度增加，復(fù)合脅迫后ROS和MDA質(zhì)量摩爾濃度均顯著高于單一脅迫。本實驗結(jié)果表明：酸雨或高溫單一脅迫后ROS和MDA質(zhì)量摩爾濃度均顯著增加，說明受到酸雨及高溫不同脅迫后， ‘杭州黃’體內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS對細(xì)胞膜造成傷害。酸雨高溫協(xié)同脅迫后，O2·－和MDA質(zhì)量摩爾濃度進(jìn)一步增加，過氧化氫質(zhì)量摩爾濃度先增加后減少，說明協(xié)同脅迫加劇對植物的傷害，與前人研究結(jié)果一致。

植物體內(nèi)的SOD，CAT和POD等3種酶是細(xì)胞抵御活性氧傷害的重要保護(hù)性酶。它們在清除O2·－，過氧化氫和過氧化物，阻止和減少自由基的形成，從而保護(hù)膜系統(tǒng)免受損傷方面起著重要作用。研究表明：酸雨脅迫后，茶梅Camellia sasanqua葉片SOD，POD和CAT活性提高［30］，以消除ROS維持體內(nèi)的氧化還原平衡；牛遠(yuǎn)等［31］研究發(fā)現(xiàn)高溫脅迫后華北落葉松Larix principis-rupprechtii幼苗 SOD和POD活性呈先上升后下降的趨勢，CAT活性呈降低趨勢。本研究結(jié)果顯示：隨酸雨脅迫處理強(qiáng)度的增加，SOD，CAT和POD活性逐漸增強(qiáng)；高溫脅迫后，3種酶活性顯著增加，但SOD活性高于pH 2.0處理，CAT和POD低于pH 2.0處理。協(xié)同脅迫后，POD活性進(jìn)一步增強(qiáng)，SOD和CAT活性先升高后降低，說明協(xié)同脅迫初期3種酶共同作用，使植物體內(nèi)ROS代謝平衡維持在正常水平，防止發(fā)生進(jìn)一步氧化損傷；POD活性在協(xié)同作用后期對過氧化氫清除起主導(dǎo)作用，在高強(qiáng)度的酸雨高溫條件下，POD清除ROS的效率更高，而pH 3.0處理下SOD和CAT活性表達(dá)受到抑制，且過度脅迫導(dǎo)致一部分已經(jīng)表達(dá)的CAT失活，說明抗氧化酶減輕膜脂過氧化傷害的作用是有限的。

植物光合作用產(chǎn)生的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物，既是植物生長發(fā)育必需的能量物質(zhì)，也是細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)［10］。近年來越來越多的研究表明碳水化合物也是一種信號分子，通過光合氮同化形成復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)，對植物的基因表達(dá)、逆境響應(yīng)、生長發(fā)育進(jìn)行調(diào)控［32］。已有研究表明：各種脅迫引起的糖限制可能是ROS積累的重要基礎(chǔ)［12，33］，BOLOURI-MOGHADDAM等［12］發(fā)現(xiàn)葡萄糖能夠通過磷酸戊糖途徑和產(chǎn)生非酶性抗氧化劑，有效清除活性氧，提高植物抵抗能力；蔗糖代謝不僅為植物發(fā)育提供能量和碳骨架，還通過提供己糖作為必需代謝物和信號分子來調(diào)節(jié)它們對非生物脅迫的響應(yīng)［34］；童貫和等［35］指出：5種不同酸雨處理下的小麥Triticum aestivum幼苗莖葉可溶性糖含量分別下降15.4%～29.4%，差異達(dá)極顯著水平。本實驗結(jié)果顯示：酸雨脅迫后 ‘杭州黃’蔗糖和淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低，而葡萄糖和果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對穩(wěn)定，可能是因為植物遭受脅迫時呼吸代謝增強(qiáng)，蔗糖和淀粉分解為葡萄糖和果糖提供能量物質(zhì)，增加抵抗能力。高溫脅迫后非結(jié)構(gòu)性碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著降低，可能是因為高溫促使植物呼吸代謝加速，葉片非結(jié)構(gòu)性碳消耗速率大于合成速率。協(xié)同脅迫后非結(jié)構(gòu)性碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步降低，一方面因為葉綠體膜結(jié)構(gòu)受損，光合作用能力下降，引起植物體內(nèi)非結(jié)構(gòu)性碳積累速度降低，另一方面有些糖類通過代謝途徑和產(chǎn)生非酶抗氧化劑，清除過量的ROS，減輕脅迫造成的傷害。

綜上所述，在酸雨脅迫后， ‘杭州黃’葉片內(nèi)產(chǎn)生大量ROS對細(xì)胞膜及光合能力造成傷害，植物抗氧化酶活性提高有效清除ROS，減輕脅迫造成的傷害；高溫脅迫后呼吸作用加快，可溶性糖和淀粉降解，為抵御脅迫提供能量和碳源；協(xié)同脅迫后傷害進(jìn)一步加深，SOD和CAT活性逐漸降低，POD保持較高活性繼續(xù)發(fā)揮抗氧化功能，同時通過調(diào)節(jié)非結(jié)構(gòu)性碳代謝參與應(yīng)激反應(yīng)，提供能量并消除過量的ROS，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抵御酸雨高溫脅迫的能力。