芒柄花素對肺動脈高壓大鼠的治療作用及機制研究

呂望 王勝男 金煥治 林岳 陳新國

近年來對肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）的認識發生明顯轉變。PAH曾經被認為是由血管收縮張力增加引起的，然而血管擴張劑沒有達到令人滿意的臨床結果。現在認為PAH的特征性血管異常

主要表現為遠端肺小動脈的內膜增厚，進而導致PAH的發生，最終右心衰竭是患者主要的死亡原因[1]。炎癥在驅動血管平滑肌細胞的過度增殖以及隨后血管結構變化中發揮了重要的作用。含核苷酸結構域的Nod樣受體家族3（NLRP3）炎性小體是一種存在于細胞內的多蛋白復合物，可被多種病原體或危險信號所激活，通過活化半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1、IL-1、IL-18等促炎細胞因子的成熟和分泌，調節免疫和炎癥反應。芒柄花素是黃芪根中的O-甲基化異黃酮植物雌激素，具有多種生物學效應，包括抗氧化、抗炎、抗腫瘤和抗癌等作用[2-4]。近年來研究提示在多種心血管疾病中也具有重要作用[5-6]，但在PAH中的作用及機制尚不明確。因此本實驗通過皮下注射野百合堿（monocrotaline，MCT）建立大鼠PAH模型，觀察芒柄花素對血管壁增厚的影響及可能的分子機制，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 MCT（美國Sigma-Aldrich）；芒柄花素 HE染色試劑盒（武漢博士德公司）；抗α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA） 抗體（美國 Sigma-Aldrich）；抗NLRP3抗體、鼠兔二抗（美國Cell Signaling Technology公司）；抗β-actin抗體（武漢博士德公司）；TNF-α、IL-1和IL-6的ELISA試劑盒（英國Abcam公司）；RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑（中國碧云天公司）。

1.2 動物分組與模型制備 32只SD雄性大鼠（體重180～220g）購自浙江省醫學實驗動物中心。動物實驗開始前適應性喂養 2～3d，自由飲食飲水，每籠飼養 4只。將32只大鼠隨機分為對照組、MCT組、芒柄花素低劑量組（25mg/kg）和芒柄花素高劑量組（50mg/kg），每組8只。除對照組外，其余各組大鼠一次性皮下注射60mg/kg MCT（將0.2g MCT溶解于1mol/L鹽酸中，先加入1mol/L氫氧化鈉調整pH至7.35～7.45，再加入0.9%氯化鈉注射液定容至10ml）；對照組大鼠注射相同劑量的0.9%氯化鈉注射液；芒柄花素低劑量和高劑量組大鼠于MCT注射2周后予芒柄花素（用橄欖油溶解，0.2mg/ml）灌胃，劑量分別為25mg/kg和50mg/kg，1次/d，連續14 d。對照組及MCT組大鼠予等量橄欖油灌胃。

1.3 血流動力學和心室重量測定 造模4周后，將大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉60mg/kg麻醉，切開右側頸部組織，分離出右頸外靜脈，將3.5號臍靜脈導管從右頸外靜脈插入右心室，可見振幅明顯的右心室波，記錄并分析右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP），處死大鼠后取出心肺，分離心臟，剪去心房，沿室間隔邊緣剪出右心室，留下室間隔和左心室，沿室間隔邊緣修剪，均由同一人員操作。稱量右心室重量（RVW）、左心室及室間隔的重量（LV+s），計算右心肥厚指數（RVHI）=RV/（LV+s）。

1.4 肺小動脈結構觀察 切取肺組織，石蠟包埋后切片3μm，按常規方法脫蠟至水，然后將切片行HE染色，選取外徑50～200μm的肌性小動脈，觀察動脈管壁厚度。

1.5 α-SMA和NLRP3表達的檢測 采用Westem blot法。提取肺動脈總蛋白，蛋白變性，使用12%SDS-PAGE分離蛋白；采用半干轉方法將蛋白轉印至NC膜上，使用5%脫脂牛奶室溫封閉NC膜1h；封閉完成后，漂洗NC膜，并在其上加入α-SMA和NLRP3的一抗于4℃過夜；次日清晨漂洗NC膜，加入鼠二抗室溫1h；二抗孵育結束后顯色，定影后通過凝膠圖像儀處理，將膠片進行掃描，再系統分析目標帶的分子量和凈光密度值。根據條光帶密度值除以β-actin作歸一化處理，得到α-SMA和NLRP3蛋白的表達水平。

1.6 NLRP3 mRNA表達水平的檢測 采用Trizol法提取肺動脈總RNA，將RNA反轉錄為cDNA，采用實時熒光定量PCR檢測mRNA水平。引物序列如下：NLRP3：5′-ACAGACAAGATTTGAAAGAAGCGGTGA，3′-TCCGAAGTTGGTGG G CCAGA，β-actin：5-CTGCCTGACGGCCAAGTC，3′-CAAGAAGGAAGGCTGGAAAAGA。以β-actin作歸一化處理后，得到NLRP3 mRNA的表達水平。

1.7 炎癥因子檢測 大鼠麻醉后，用5ml注射器在腹主動脈抽取動脈血，3 000r/min離心10min，并儲存于-80℃保存。采用ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-1和IL-6水平。具體操作按照試劑盒的說明。

1.8 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnet-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.14 組大鼠RVSP、RVW、RVHI的比較 與對照組相比，MCT 組RVSP、RVW、RVHI均顯著增加（均P＜0.05）；與MCT組比，芒柄花素低劑量組和芒柄花素高劑量組RVSP、RVW、RVHI均顯著降低（均P＜0.05），見表 1。

2.2 4組大鼠肺血管壁增厚以及α-MSA表達的比較HE染色結果表明，與對照組比較，MCT組的肺動脈管壁明顯增厚，管腔明顯狹窄，而芒柄花素低劑量組和芒柄花素高劑量組可明顯改善這一病理變化，詳見圖1（見插頁）。與對照組相比，MCT組α-SMA的表達明顯上調（P＜0.05），而芒柄花素低劑量組和芒柄花素高劑量組α-SMA顯著降低（P＜0.05），詳見圖2和表2。

表14組大鼠RVSP、RVW、RVHI的比較

圖2 4組大鼠肺組織α-SMA蛋白表達電泳圖

表2 4組大鼠α-SMA蛋白表達水平的比較

2.3 4組大鼠血清 TNF-α、IL-1、IL-6、水平的比較 與對照組相比，MCT 組血清 TNF-α、IL-1、IL-6、水平均明顯增加（均P＜0.05），而芒柄花素低劑量組和芒柄花素高劑量組TNF-α、IL-1、IL-6、水平均顯著降低（均P＜0.05），見表 3。

表3 4組大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6水平的比較（pg/ml）

2.4 4組大鼠NLRP3 mRNA以及蛋白表達水平的比較與對照組相比，MCT組NLRP3 mRNA和蛋白表達水平均明顯上調（均P＜0.05），而芒柄花素低劑量組和芒柄花素高劑量組NLRP3 mRNA水平以及蛋白表達水平均顯著降低（均P＜0.05），見表4。

表4 4組大鼠NLRP3 mRNA以及蛋白表達水平的比較

3 討論

PAH患者由于肺小血管阻力和壓力的逐漸增加損害右心室功能，導致右心衰竭，并最終導致患者死亡[7]。本研究中對于MCT誘導的PAH大鼠模型，芒柄花素治療使得反映肺動脈壓的RVSP明顯下降。右心室對壓力負荷增加的反應被認為是提示預后的關鍵[8]。相比于對照組，MCT處理的大鼠肺小動脈管腔狹窄以及右心室肥厚，芒柄花素減輕MCT誘導的肺小動脈重構和隨后出現的右心肥厚。金雀異黃素、白藜蘆醇已被證明可預防MCT誘導的大鼠PAH[9-10]，雖然這些研究已經證明了天然抗氧化劑在PAH中的潛在益處，但其潛在機制尚未完全確定。本研究結果提示芒柄花素作為PAH的另一種潛在治療方法，并發現了PAH中抗炎劑的共同作用機制。

炎癥在人類PAH以及實驗模型中都起著關鍵作用[11-12]。對于外界損傷和應激的反應，肺血管細胞產生炎癥介質，從而招募炎癥細胞。炎性細胞可能延長細胞因子和生長因子的釋放，形成正反饋回路。在PAH中這些過程可導致血管重塑、基質重塑、膠原沉積、血管細胞增殖和遷移，最后肺阻力增加和右心衰竭。除了增加血管周圍和血管內的積累外，某些細胞因子和趨化因子的循環水平異常升高。其中包括IL-1β、IL-6、IL-8、單核細胞趨化蛋白-1、FractAlgin、CcL5/RANTES 和 TNF-α[13]。這些細胞因子和趨化因子中的一些與PAH患者的不良臨床結果密切相關，并且可以作為疾病進展的生物標志物。在PAH的患者中觀察到IL-1β和TNF-α與細胞外基質蛋白的積累有關，而其他的如IL-6與平滑肌細胞的增殖有關[14]。TNF-α相關凋亡誘導配體在許多PAH實驗模型中已被證實在內皮細胞凋亡和平滑肌細胞增殖中起關鍵作用，其抑制與疾病病理的預防呈正相關。在骨形態發生蛋白和5-羥色胺和IL-1信號調節下，骨保護素在PAH患者的平滑肌細胞和血清中高表達，并能刺激其遷移和增殖[15]。本研究同樣發現MCT誘導的PAH使得血清TNF-α、IL-1和IL-6增加，而芒柄花素能抑制它們的增加，說明芒柄花素能通過抑制炎癥反應，從而抑制肺小動脈的重構。最終芒柄花素作為一種抗炎劑可以抑制肺動脈壓力的升高，防治右心衰竭。

NLRP3在多種類型的肺損傷中被激活。肺泡巨噬細胞NLRP3炎性小體可增加肺泡伸展性，誘導IL-1的釋放。在急性肺損傷模型中NLRP3缺陷小鼠表現出炎癥反應的抑制和肺上皮細胞凋亡的減少。同樣的抑制NLRP3的表達可以降低TNF-α、IL-6以及減緩急性肺損傷[16]。多個抗炎劑在MCT誘導的PAH都展現了良好的作用，進一步提示諸如TNF-α、IL-1以及IL-6在PAH中也發揮了關鍵的作用[17-18]。本研究表明MCT可以誘導TNF-α、IL-1以及IL-6的升高和NLRP3炎性小體的激活。考慮到TNF-α、IL-1以及IL-6在PAH發病機制中的作用，以及炎性體和炎癥因子的相互作用，我們認為抗炎劑對PAH的作用可能就是通過抑制NLRP3炎性小體來實現。

總之，芒柄花素通過抑制NLRP3信號通路減輕炎癥反應，從而減少肺小動脈的重構，最終治療PAH。炎癥是PAH發生、發展的重要過程。因此，本研究發現NLRP3炎癥通路在PAH中可能的重要作用，為PAH的防治提供了新的治療思路。