外周血單核細胞COX-2表達與MPA形成和冠心病的關系研究

黃青華 沃銘毅 陳敏強 袁武鋒 趙嫣 費鮮明

動脈粥樣硬化（AS）是冠心病等心腦血管疾病的主要病理基礎[1]。慢性炎癥反應對AS的發展起著重要促進作用，其中單核細胞與血小板聚集體（MPA）形成所誘導的炎癥反應在AS的發生和發展中扮演重要的角色[2-3]。MPA可通過NF-κB信號通路誘導單核細胞活化而引起環氧化酶-2（COX-2）表達增高[4]；筆者既往研究表明，木瓜蛋白酶可通過抑制中心因子AKT磷酸化而降低MPA誘導的單核細胞COX-2表達，并抑制單核細胞粘附和分泌功能，提示單核細胞COX-2可能在AS及冠心病的發生、發展中扮演重要角色[5]。因此，單核細胞COX-2表達增高可能有助于預測AS及冠心病的發生，并可作為其風險標志物。筆者通過觀察冠心病患者外周血單核細胞COX-2表達，探討其與MPA形成和冠心病發生之間的關系，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2017年10月1日至12月31日在我院住院的冠心病患者66例，男41例，女25例，年齡34～78（46.0±25.0）歲；其中穩定型心絞痛（SA）37 例，男24 例，女 13 例，年齡 34～72（47.6±18.3）歲；不穩定型心絞痛（UA）29例，男 19例，女 10例，年齡 37～78（49.2±17.1）歲。納入標準：（1）AS 性心臟病患者；（2）符合冠心病診斷標準；（3）首次入院確診者；（4）入院后治療前。排除標準：（1）急性心肌梗死；（2）急慢性感染或炎癥；（3）高血壓；（4）肝腎功能異常；（5）惡性腫瘤；（6）腦血管疾病；（7）動靜脈血栓史；（8）手術后；（9）孕婦；（10）2 周內服用過任何藥物；（11）1個月內使用過抗血栓藥物。收集同期在我院健康體檢者30例作為正常對照組，男20例，女 10 例，年齡 35～72（45±23）歲；均無常規血液學檢驗、超聲、X線等檢查異常者。本研究均經患者或其家屬以及體檢人員知情同意。各組間性別、年齡的比較均無統計學差異（均P＜0.05）。

1.2 主要試劑與儀器、材料 CD41-FITC及CD14-PE單克隆抗體（法國Immunotech公司），COX-2單克隆抗體（美國Cell Signaling生物技術公司），細胞裂解液和TEN緩沖液（自配），MCP-1 ELISA試劑盒（美國Bioscience公司），淋巴細胞分離液（北京鼎國昌盛生物技術公司），RPMI1640培養液（上海佳和生物科技有限公司）。FBS（美國Hyclone公司）。FC500-MCL流式細胞儀（美國Beckman-Coulter公司）、Mindray BC-6800血細胞分析儀和CRP-M100分析儀（中國邁瑞醫療公司），酶標儀（美國BIO-RAD公司）、改良Neubauer計數板。

1.3 MPA水平和炎癥指標測定 清晨空腹采集冠心病患者和志愿者靜脈血。采集枸櫞酸三鈉1∶9抗凝血2.7ml，加入CD14和CD41單克隆抗體，以流式細胞儀檢測同時表達CD41和CD14的血小板比例，即MPA水平（%）；采集EDTA-K2抗凝血2ml，以血細胞分析儀測定WBC、中性粒細胞、淋巴細胞，并計算中性粒細胞-淋巴細胞比值（NLR），以CRP-M100分析儀測定超敏C反應蛋白（hs-CRP）濃度；采集無抗凝血 3ml，1 500g離心分離血清，采用單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）ELISA試劑盒測定MCP-1水平。操作均嚴格按照儀器和試劑盒說明書進行。

1.4 外周血單核細胞分離、處理和COX-2水平檢測按照筆者以往研究中的單核細胞分離、處理和Western blot檢測方法[5]。具體為：取健康人員和冠心病患者靜脈血3～5ml，肝素抗凝，Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（PBMC），用含10%FBS的RPMl1640培養液懸浮，置6孔板中培養，37℃、5%CO2孵箱貼壁2h后，用預溫培養基洗去未黏附細胞，懸浮細胞可重復黏附，得到更多貼壁，以培養基重新懸浮貼壁細胞，以流式細胞儀檢測表達CD14的細胞比例，表達率＞90%為符合要求。然后以Neubauer計數板計數并調整細胞數為5×105個/ml。以β-actin為內參，前述單核細胞懸液以細胞裂解液裂解細胞，充分混勻后取等量標本上樣以SDS-PAGE電泳；轉膜2h；脫脂奶粉封閉后COX-2單克隆抗體，孵育過夜；TBST漂洗膜；用HRP標記的抗體孵育；ECL發光底物顯色后在Bio-Rad成像系統曝光。曝光結果用Image J軟件進行光密度檢測。

1.5 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用成組t檢驗，相關性分析采用Pearson相關，危險因素分析采用logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組炎癥指標、MPA和COX-2水平的比較 冠心病組 hs-CRP、MCP-1、WBC和NLR水平均高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；UA組hs-CRP、MCP-1、WBC和NLR水平以及MPA和COX-2水平均高于SA組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。見表1、圖1。

2.2 冠心病患者COX-2水平與MPA及各炎癥指標水平的相關性 相關性分析顯示，COX-2表達水平與MPA、MCP-1、NLR 和 hs-CRP 均呈正相關（r=0.703、0.631、0.603、0.532，均P＜0.01）。COX-2 水平升高的冠心病患者MPA水平顯著高于COX-2水平正常的患者，MPA水平升高冠心病患者COX-2水平顯著高于MPA水平正常的患者（P＜0.01）；見圖2。

表1 各組炎癥指標的比較

圖1 SA和UA組患者MPA和COX-2水平比較（與對照組比較，*P＜0.01；與 SA 組比較，**P＜0.01）

2.3 冠心病患者logistic回歸分析結果 單因素回歸分析顯示COX-2、MPA、年齡、各炎癥指標均為冠心病的危險因素，多因素回歸分析顯示，除年齡、性別和WBC之外，其余各指標均為冠心病的獨立危險因素，COX-2比其余指標具有更高的OR值；見表2。

3 討論

圖2 冠心病危險因素單核細胞COX-2水平與MPA水平的關系（與COX-2正常組、MPA正常組比較，**P＜0.01）

表2 冠心病危險因素logistic回歸分析結果

AS是一種慢性炎癥性病變過程，血小板和WBC參與的炎癥反應在動脈硬化性血栓形成性疾病如冠心病的發生和發展中扮演重要角色[6]。眾多研究表明，炎癥在AS相關的心血管疾病發生、發展過程中起著重要的作用[7]；并且單核細胞誘導的慢性炎癥反應及巨噬細胞形成在AS的早起過程中起著重要的作用[8]。慢性炎癥多以WBC增高和各種炎癥介質分泌為基本現象，從而可以各炎癥指標的水平作為其評價基礎。單核細胞活化是一個復雜的過程，體現為趨化、黏附功能增強，并以炎癥因子如MCP-1分泌等為基本表征[9]。在本研究中，冠心病患者炎癥指標 MCP-1、hs-CRP、WBC和NLR水平明顯高于正常人群，顯示各炎癥指標變化趨勢具有一致性，符合炎癥反應的基本表現。以上結果一方面表明炎癥反應與冠心病發生關系密切，同時也表明炎癥反應增強可使患者AS風險增加，從而導致冠心病的發生。另外，UA患者比SA患者具有更高水平炎癥指標表達，表明多種因素所誘導的炎癥反應可能與AS的進展以及冠心病病情嚴重程度有關。因此，測定炎癥指標水平可能有助于預測冠心病風險以及評估患者病情。

單核細胞與血小板黏附形成MPA并誘導兩者相互激活在AS發生中起著尤為重要的作用[8]。MPA及血小板源性細胞介質協同誘導單核細胞信號轉導通路活化、促使其分泌和表達多種活性因子、顯著增強其趨化及黏附能力并介導炎癥細胞黏附，從而放大或延長炎癥反應，是AS發生、發展的上游病理生理基礎[10]。這充分表明MPA及其誘導的單核細胞活化在AS性疾病的發生、發展的早期過程中具有極為重要的作用。MPA形成可顯著增強單核細胞功能，有利于活化單核細胞侵入損傷內皮細胞參與炎癥反應，并轉化為巨噬細胞吞噬氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL），從而形成泡沫細胞，這是AS發生的關鍵[11]。因此，MPA形成和炎癥反應與心血管疾病關系密切。MPA形成過程中PS/PSGL-1連接可激活MAPK，通過MAPK ERK/p38而使單核細胞COX-2表達升高，調控單核細胞活化和黏附[4]。其中，COX-2可調節前列環素的產生從而對慢性炎癥的發生具有重要促進作用[4]。在筆者的前期研究中顯示，木瓜蛋白酶抑制COX-2蛋白表達的同時，能降低單核細胞的黏附及其分泌炎癥蛋白MCP-1[5]，表明抑制COX-2可有效抑制炎癥反應；因此，COX-2可能作為炎癥調控的靶點，其表達增加可能是MPA形成并激活單核細胞參與炎癥反應從而導致AS發生的關鍵物質，而若能有效抑制其表達可能有助于AS相關疾病的防治。盡管筆者在本研究中只檢測和觀察了單核細胞COX-2蛋白表達的改變，并未同時采用PCR法測定COX-2 mRNA表達，但研究結果顯示，SA和UA患者均表現為MPA形成和單核細胞COX-2表達增加，并且UA患者比SA患者MPA和COX-2具有更高水平，表明COX-2表達增加與MPA形成增多具有一致性。而進一步研究顯示，冠心病患者單核細胞COX-2表達水平與MPA比例呈正相關，并與炎癥指標水平具有正相關，進一步揭示和證實以COX-2表達為代表的炎癥標志物水平增加與MPA形成誘導單核細胞活化引起的炎癥反應程度增高具有明顯相關性。結果同時也揭示了COX-2表達水平高低與冠心病進展與否有密切的關系。因此，COX-2作為重要的炎癥調控分子，其在MPA誘導的單核細胞活化后的炎癥調控中扮演著重要角色，可能有助于冠心病的預測和病情評估。

炎癥標志物水平在冠心病預測及其風險評估中具有重要價值[6]。報道顯示，hs-CRP、WBC和NLR對冠心病預測有較高價值，并與病情嚴重程度有關；并且hs-CRP和NLR可作為急性冠脈綜合征的獨立危險因素[12-14]。因此，炎癥標志物在冠心病診斷與預后中具有重要的意義。本研究在預測冠心病的各種炎癥指標中，炎癥調控因子COX-2具有最高的OR值，單因素和多因素分析分別為7.812和6.332，表明患者單核細胞COX-2表達水平升高可顯著增加冠心病的風險，并作為其獨立危險因素有助于預測冠心病發生的風險；同時結果也進一步提示并證實如有效抑制其表達可能有助于降低冠心病風險。

綜上所述，本研究通過對冠心病患者外周血單核細胞COX-2表達水平進行評估，初步提示COX-2表達增高與MPA形成增多具有聯動關系，并可作為冠心病風險的獨立預測因子。在此基礎上，如能進一步結合COX-2 mRNA檢測進行研究，將更有利于臨床實際應用。