冷鮮雞冷藏保存過程中菌群結構變化分析

桂國弘，楊 華，朱江群，朱建芬，肖英平，徐 娥，*

(1.貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025； 2.浙江省農業科學院 農產品質量標準研究所，浙江 杭州 310021； 3.余杭區余杭街道農業公共服務中心，浙江 杭州 311121； 4.余杭區塘棲鎮農業公共服務中心，浙江 杭州 311109)

冷鮮雞是指經檢疫檢驗后屠宰的雞胴體，迅速冷卻使其溫度至0～4 ℃，并保持在0～4 ℃溫度下加工、流通和零售的鮮雞肉[1]。我國是肉類的生產和消費大國，冷鮮雞由于營養價值高、口感好等特點，越來越得到市場的認可，成為雞肉消費的趨勢[2]。但冷鮮雞在屠宰加工過程中易受到微生物的污染，污染的微生物在低溫冷藏條件下仍可利用雞肉中豐富的營養物質生長繁殖[3]，既影響食品安全，也導致冷鮮雞肉產品貨架期縮短。目前對冷鮮雞的保質期暫無明確的規定，同時對于冷鮮雞菌群結構的變化也研究較少。本研究從冷鮮雞冷藏保存過程中反映其腐敗變質的參數和微生物結構變化角度出發，探究冷鮮雞在冷藏期間雞肉中揮發性鹽基氮含量、菌落總數、大腸埃希菌總數和菌群結構的變化規律，為制定冷鮮雞的保質期標準提供參考，也為冷鮮雞污染微生物控制技術的開發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

25只冷鮮雞樣品采自華東地區一家禽定點屠宰場，放入無菌袋中，置于4 ℃保藏。

無菌袋購于青島海博生物技術有限公司；緩沖蛋白胨水培養基、平板計數瓊脂培養基和結晶紫中性紅膽鹽-4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷瓊脂(VRBA-MUG)購自杭州微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自美國Zymo Research公司。

Eppendorf 5427 R臺式高速離心機，德國Eppendorf公司；SW-CF-IF 超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.2 樣品制備

冷鮮雞在4 ℃保藏第0、1、3、5、7 天時，各取5只在無菌條件下對半分開，其中一部分分割雞肉，用于揮發性鹽基氮測定；另一部分放置于無菌袋中，加入生理鹽水沖洗(m/V=1∶1)，并用手握住無菌袋猛烈振蕩1 min，取出雞肉樣品，菌液用于微生物平板計數并進行菌群結構分析[4]。

1.3 揮發性鹽基氮測定

揮發性鹽基氮(total volatile basic nitrogen，TVBN)按照《GB 2707—2016 食品安全國家標準 鮮(凍)畜、禽產品》方法測定。

1.4 菌落總數和大腸桿菌數測定

菌落總數、大腸埃希菌數分別按照《GB 4789.2—2016食品微生物學檢測 菌落總數》《GB 4789.38—2012食品微生物學檢測 大腸埃希氏菌計數》方法測定。

1.5 微生物基因組DNA提取和16S rRNA基因PCR擴增

使用細菌基因組DNA提取試劑盒按照試劑盒使用說明提取細菌DNA。以提取的DNA為模板，使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細菌16S rRNA基因V3～V4區進行PCR擴增。

1.6 高通量測序

測序由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。采用Illumina Hiseq 2500高通量測序平臺對冷鮮雞表面細菌16S rRNA基因的V3～V4區進行測序。根據條碼序列匹配雙端測序序列與樣品，對條碼序列及引物序列進行切除。使用FLASH 1.2.7軟件將雙端序列進行融合，得到未加工序列。使用QIIME V1.7.0軟件將序列進行質控和過濾后，獲得優質序列[5-6]，之后通過UCHIME算法將得到的優質序列與參考數據庫進行比對，發現嵌合體序列，去除后獲得有效序列[7-8]。使用Uparse 7.0軟件依據相似性≥97%將質控后的有效序列聚類成為操作分類單元(operational taxonomic unit，OUT)[9]。采用QIIME默認參數計算各樣品的α多樣性指數和物種分布。為了比較不同冷藏保存時間的菌群結構差異，使用R軟件(Version 2.15.3)軟件包對樣品之間的菌群結構相似度進行非度量多維尺度(nonmetric multidimensional scaling，NMDS)分析。

1.7 統計分析

將菌落計數結果計算成每克樣品中細菌的含菌量，采用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 冷鮮雞揮發性鹽基氮、菌落總數、大腸埃希菌數變化情況

冷鮮雞的揮發性鹽基氮(total volatile basic nitrogen，TVBN)含量隨著保存時間的延長而逐漸增加(表1)。在冷藏條件下保存第1、3 天，其含量分別為7.27、10.80 mg·(100 g)-1，與第0天的新鮮樣品相比，無顯著差異(P>0.05)。保存第5、7 天時，TVBN含量分別為14.96、29.84 mg·(100 g)-1，均顯著高于新鮮雞肉樣品濃度(P<0.05)。根據《GB 2707—2016食品安全國家標準 鮮(凍)畜、禽產品》要求，冷鮮雞肉揮發性鹽基氮不得超過15 mg·(100 g)-1，因此冷鮮雞冷藏5 d后，其TVBN存在超標的風險。

隨著保存天數的增加，冷鮮雞肉中的菌落總數與大腸埃希菌數量不斷增加(表1)。雞肉中菌落總數由第0天的4.46×106CFU·g-1增加至第7天的1.87×108CFU·g-1，自第3天起菌落總數開始顯著增加(P<0.05)。大腸埃希菌總數在雞肉保存第5 天和第7 天時顯著高于前3天(P<0.05)。

冷鮮雞肉樣品經過了屠宰、脫毛、凈膛、清洗等加工過程，胴體表面易被微生物污染。污染的微生物以雞肉為基質進行生長繁殖，因此菌落總數、大腸埃希菌數量在保存過程中不斷增加。同時微生物生長繁殖的過程伴隨著雞肉的腐敗變質[10-12]，因此TVBN含量相應地持續升高。

2.2 冷鮮雞菌群高通量測序

2.2.1 菌群豐富度及多樣性

表1冷鮮雞冷藏保存過程中的揮發性鹽基氮、菌落總數和大腸埃希菌數變化情況

Table1TVBN contents， bacterial colonies and totalE.colicounts of chilled chicken in different days of cold storage

組別Group揮發性鹽基氮含量TVBN contents菌落總數Total number of bacterial colonies大腸埃希菌數Total number of E.coliD05.51±1.56 c(4.46±1.28)×106 c(1.48±1.15)×106 bD17.27±3.05 c(6.81±3.20)×106 c(1.67±0.86)×106 bD310.80±2.13 c(5.15±3.12)×107 b(1.66±1.60)×106 bD514.96±1.39 b(1.32±0.99)×108 a(5.10±1.43)×106 aD729.84±8.56 a(1.87±1.03)×108 a(5.78±1.64)×106 a

D0，D1，D3，D5，D7分別為在4 ℃保藏第0，1，3，5，7天的樣品組。同列數據后沒有相同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

D0，D1，D3，D5，D7 represented the groups of storage for 0，1，3，5 and 7 days at 4℃. Data without the same letters within the same column indicated significant difference atP<0.05. The same as below.

經過質控、過濾等處理后，在25個樣品中獲得有效序列951 905條，其中各組樣品的有效序列為36 826～39 329條(表2)，樣品間的有效序列差異較小。所獲得的有效序列根據97%相似性水平進行OTU數量分析，在保存第7天的樣品組OTU數量顯著降低(P<0.05)；同樣地，反映樣品微生物豐度指數Chao 1和ACE指數也顯著降低(P<0.05)。各組樣品的覆蓋度指數(Good’s coverage)均在0.995～1.000，并且其稀釋曲線已經趨于平穩(圖略)，表明測序已趨于飽和，測序深度已基本覆蓋樣品中所有物種，測序結果能反應雞肉微生物菌群多樣性組成。

通過Venn圖(圖1)可知，在冷鮮雞冷藏保存的5個時間點中，共有352個OTU是共有的。但在冷鮮雞4℃保藏第7 天時，其特有的OTU數量為110個，顯著多于冷藏保存5 d內各個時間點特有的OTU數量。由此看出，菌群數量隨著冷藏保存時間的增加其獨有OTU數量也增多，表明其菌群多樣性隨著冷藏保存時間的增加而增多。

2.2.2冷鮮雞冷藏保存過程中菌群結構變化

在門水平上，變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為優勢菌門(圖2)，其相對豐度在各個實驗組都超過99%。

在不同的冷藏保存期間4種優勢菌門的相對豐度見圖3。變形菌門的相對豐度隨著冷蔵天數的增加而增加，冷藏第7天時變形菌門菌群含量顯著高于冷藏第0、1、3、5 天時(P<0.05)，相對豐度由38.13%～46.96%增加到64.50%。厚壁菌門隨著冷藏天數的增加相對豐度減少，在冷藏保存第5天和第7天，其相對豐度分別為27.29%和18.80%，均顯著低于第0 天的50.09%(P<0.05)。放線菌門和擬桿菌門的相對豐度在不同時間點均無顯著差異(P>0.05)。這與我們前期的研究結果相一致[4]。

表2各組樣品測序概況

Table2Overview of sequencing results of each group

組別Group序列數量SequencesOTU數量OTUs香農指數Shannon index辛普森指數Simpson index豐度指數Chao1 index豐度指數ACE index覆蓋度指數Goods coverageD038 962±1 254 654±22 a5.838±0.275 a0.950±0.013650.267±24.747 a672.075±28.511 a0.996±0.0005D139 329±1 638710±24 a5.669±0.290 a0.931±0.018722.948±30.914 a732.598±24.057 a0.995±0.0002D336 850±1 834579±21 a5.499±0.218 a0.938±0.018577.775±20.169 a593.157±16.150 a0.996±0.0002D538 414±2 719607±32 a5.344±0.185 ab0.924±0.012692.252±60.205 a684.271±45.943 a0.995±0.0007D736 826±1 245284±43 b4.499±0.414 b0.871±0.053277.236±41.693 b282.733±39.182 b0.998±0.0002

圖1 不同冷藏保存時間冷鮮雞表面菌群OTU Venn圖Fig.1 Venn diagram of OTUs in chilled chickens of different storage days

D01～D05，D31～D35，D51～D55，D71～D75分別為在4℃保藏第0、1、3、5、7天的5個樣品。D01-D05，D31-D35，D51-D55，D71-D75 represented 5 samples of storage for 0，1，3，5，7 days at 4 ℃圖2 冷鮮雞不同冷藏時間菌群在門水平上的變化Fig.2 Relative abundance of sequences at phylum level in chilled chickens of different storage days

沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。The bars without the same lowercase letters showed the significant difference(P<0.05).圖3 冷鮮雞不同冷藏時間4種優勢菌門的相對豐度Fig.3 Four dominant phyla in chilled chickens of different storage days

在屬水平上，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、腸球菌屬(Enterococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、乳球菌屬(Lactococcus)、埃希氏菌屬(Escherichia)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)和金黃桿菌屬(Chryseobacterium)為主要的優勢菌屬(圖4)，這10種菌屬的相對豐度平均約占整個菌群的52.24%。

圖4 冷鮮雞在不同冷藏保存時間10種主要菌屬的相對豐度Fig.4 Relative abundance of top 10 genera in chickens of different cold storage days

不同冷藏天數的冷鮮雞表面的菌落結構變化較大。隨著冷藏天數的增加，在相對豐度大于0.1%的屬中，有9個屬的相對豐度顯著增加(表3)。其中肉食桿菌屬(Carnobacterium)、乳球菌屬(Lactococcus)、巨球菌屬(Macrococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、希瓦氏菌屬(Shewanella)是典型的肉食腐敗菌[13-14]。假單胞菌屬因其能適應低溫環境，是冷藏肉中的優勢菌也是主要的腐敗菌，同時能產生氨等腐敗產物[15-18]。本試驗中，假單胞桿菌屬在冷藏保存第7 天時相對豐度達到19.53%，成為冷藏肉的表面優勢腐敗菌，與已有研究結果一致[19-21]。嗜冷桿菌屬、希瓦氏菌屬也是冷鮮肉中的常見腐敗菌，在冷藏過程中快速生長，使肉腐敗變質[22-27]。在冷藏過程中，由于這些腐敗菌的增殖，導致冷鮮肉的腐敗，這也與TVBN含量隨著冷藏時間的延長而升高相一致。乳球菌屬、巨球菌屬的相對豐度出現了先增加后降低的趨勢，可能由于其他的菌屬如假單胞菌屬或嗜冷桿菌屬，在冷藏環境下的大量增殖，導致乳球菌屬、巨球菌屬第5天后的相對豐度降低。

隨著冷藏天數的增加，不動桿菌屬(Acinetobacter)、擬桿菌屬(Bacteroides)、布勞特氏菌屬(Blautia)、腸球菌屬(Enterococcus)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)等10個菌屬的相對豐度顯著降低(表4)。值得注意的是，擬桿菌屬、布勞特氏菌屬、腸球菌屬、糞桿菌屬、瘤胃球菌屬和SMB53等是典型的肉雞腸道內容物和糞便中的菌屬[28]。該結果反映了冷鮮雞在屠宰加工過程中雞肉表面的污染微生物主要來源于肉雞腸道和糞便。

2.2.3 樣品的聚類與非度量多維尺度分析

冷鮮雞表面的菌群結構在冷藏保存過程中發生一定的變化，根據各組樣品間的加權UniFrac距離(圖5)和基于不同保存時間樣品OTU進行非度量多維尺度分析(non-metric multi-dimensional scaling， NMDS)分析(圖6)。結果表明，不同保存時間的樣品表現出不同的聚類趨勢，特別是在冷藏保存后第7天，菌群結構有顯著不同的聚類。相同天數樣品菌群結構相似性較高，不同天數的樣品相似性較小。

3 結論

冷鮮雞在冷藏保存過程中，揮發性鹽基氮含量逐漸升高，特別是在冷藏保存第5天后，其含量已超過國家限量標準；菌落總數、大腸埃希菌總數隨著冷藏時間的延長而增多；在菌群結構組成方面，肉食桿菌屬、假單胞菌屬、嗜冷桿菌屬、希瓦氏菌屬等腐敗菌的相對豐度顯著增加，而擬桿菌屬、布勞特氏菌屬、腸球菌屬、糞桿菌屬、瘤胃球菌屬等肉雞自身來源的污染微生物逐漸降低。說明了冷鮮雞肉的微生物污染起始階段主要受肉雞自身攜帶微生物的污染，而后逐漸演替成腐敗菌為優勢菌群，導致雞肉的腐敗變質。

表3冷鮮雞冷藏過程中菌群相對豐度顯著升高的屬

Table3The genera with significantly enhanced relative abundance in chilled chicken during the increasing days of cold storage

菌屬Genus不同冷藏保存天數菌群的相對豐度Relative abundance of the genus in different cold storage days/%01357P值P-value肉食桿菌屬Carnobacterium0.0310.0250.2580.2351.6130.000金黃桿菌屬Chryseobacterium0.7001.6143.0803.4971.2600.018乳球菌屬 Lactococcus1.2963.53015.1846.6305.9130.000巨球菌屬 Macrococcus1.8350.7403.8861.4861.7590.001海洋芽孢桿菌屬Marinibacillus0.0000.0000.0000.0000.8880.020假單胞菌屬 Pseudomonas0.1760.3470.7130.57419.5260.000嗜冷桿菌屬 Psychrobacter2.3112.27816.76512.91816.8010.002希瓦氏菌屬Shewanella0.0640.1200.1420.1880.9830.002需鹽桿菌屬Salegentibacter0.0000.0000.0000.0001.4550.041

僅選擇相對豐度大于0.1%的屬進行統計分析和列出顯著差異的菌屬。下表同。

The genera representing more than 0.1% of the total sequences were compared， and genera showing significant differences were listed. The same as below.

表4冷鮮雞冷藏過程中菌群相對豐度顯著降低的屬

Table4The genera with significantly reduced relative abundance in chilled chicken during the increasing days of cold storage

菌屬Genus不同冷藏保存天數菌群的相對豐度Relative abundance of the genus in different cold storage days/%01357P值P-value不動桿菌屬Acinetobacter17.43827.05912.36911.8264.2930.000擬桿菌屬Bacteroides1.0780.2760.0980.1200.0070.046布勞特氏菌屬Blautia1.1330.5240.3160.2070.1490.044水棲菌屬Enhydrobacter1.1280.7980.9660.5660.1790.006腸球菌屬 Enterococcus12.1741.7211.1921.4810.7420.007埃希氏菌屬 Escherichia6.9143.4431.0462.1010.3350.039Faecalibacterium1.2120.4050.2040.1650.0450.048瘤胃球菌屬Ruminococcus1.4400.5380.1720.0710.0230.001SMB531.8621.9851.8231.6400.5060.006葡萄球菌Staphylococcus1.9181.0231.6980.8040.2010.000

圖5 各樣品菌落結構的聚類分析Fig.5 Cluster analysis of the dissimilarity of bacterial community structure among the samples

圖6 各樣品菌落結構的NMDS分析Fig.6 Non-metric multi-dimensional scaling (NMDS) of the dissimilarity of bacterial community structure among the samples