百子蓮2個ARF基因與2個Aux/IAA基因的全長克隆與序列分析

楊 舟，呂 可，呂 珊，王俊杰，張 荻

(上海交通大學 農業與生物學院 園林科學與工程系，上海 200240)

百子蓮(Agapanthuspraecox)又稱藍百合，是百子蓮科百子蓮屬多年生觀賞花卉，原產于非洲南部，花量大而美麗，在歐美地區常作為庭院觀賞和高檔鮮切花應用，具有良好的觀賞價值和應用前景，我國于2002年將其引入上海地區，引種栽培研究中發現夏季高溫高濕氣候引起百子蓮結實率與種子萌發率下降，嚴重限制了品種生產與推廣。2010年后建立百子蓮體細胞胚胎發生體系、組織培養擴繁與種質資源保存等體系，為該品種在園林景觀的應用奠定了重要技術保障[1-2]。目前，體細胞胚胎發生是百子蓮快速繁殖和優質種質資源保存的主要方法[1]。

生長素作為唯一具有極性運輸特征的植物內源激素，是大多數植物體細胞胚胎發生必不可少的啟動因子，對花芽分化、根莖生長發育、器官發育與衰老、維持頂端優勢、胚胎極性結構建立等諸多植物生長過程起到重要的調節作用[3-4]。近年研究表明，生長素對于百子蓮花芽分化、胚胎發育和胚性愈傷組織誘導等生理過程具有重要的調控作用[2]。生長素信號通過作用于下游復雜的調控網絡調控植物多方面的生物過程，其主要元件(TIR/AFB、Aux/IAA與ARF)都具有各自的基因家族[5]。其中，生長素響應因子(auxin response factors，ARF)與生長素信號負轉錄調控因子生長素/吲哚乙酸(auxin/indole acetic acid proteins，Aux/IAA)是參與生長素信號調控下游基因表達的主要轉錄因子[6-7]。Aux/IAA蛋白通過蛋白互作控制ARF蛋白的活性，進而調節生長素相關基因的表達[8-9]。當植物體內的生長素含量較低時，Aux/IAA蛋白與ARF蛋白相結合，抑制生長素相關基因的轉錄；當生長素含量上升時，生長素會結合自身受體蛋白TIR1，促進Aux/IAA蛋白的降解，減少其對ARF轉錄因子的抑制作用，使得ARFs能夠調控生長素信號應答基因的表達[5， 9]。

前期有關百子蓮體胚體系構建的研究發現，適宜濃度的外源生長素類調控物質毒莠定PIC(4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸，picloram)對于百子蓮愈傷組織的胚性啟動與胚性保持具有良好的誘導及調控作用[10]，而濃度偏高或偏低都會導致細胞胚性喪失或退化(圖1-A)，并通過影響內源生長素信號調控體細胞胚性發育與形態建成(圖1-B)。應用二代測序技術對不同濃度PIC繼代的胚性愈傷組織(embryogenic callus，EC)進行比較轉錄組學研究，發現在胚性穩定維持的細胞中ARF家族基因與IAA20表達增強；與非胚性細胞相比，EC中的Aux/IAA家族的IAA20、IAA26、IAA30與IAA4均呈現下調表達，而ARF家族基因明顯上調表達。因此推斷生長素信號在百子蓮愈傷組織的胚性誘導與保持過程中具有重要調控作用，且IAA4、IAA26、IAA20、IAA30、ARF1與ARF2等基因可能在此過程中發揮重要的信號傳導調控作用(圖2)。

本文通過百子蓮體胚發生差異表達文庫，獲得與生長素信號轉導途徑密切相關的ARF和Aux/IAA基因的核心序列，應用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技術克隆其中2個Aux/IAA與2個ARF家族基因全長，并分析蛋白結構功能，為揭示其在體胚誘導調控過程中的分子作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

A，百子蓮愈傷組織胚性保持的細胞形態學差異；B，百子蓮胚性愈傷組織細胞內源IAA含量差異；不同小寫字母代表生長素含量在不同樣品間的顯著性差異，LSD P<0.05。A， PIC plays an important role in Agapanthus praecox embryogenic induction and keeping; B， IAA contents of callus and embryogenic callus in Agapanthus praecox. The bars with different lowercase letters showed the significant difference (P<0.05).圖1 不同濃度PIC繼代的百子蓮胚性愈傷組織Fig.1 Embryogenic callus of Agapanthus praecox treated with different concentrations of PIC

圖2 百子蓮胚性愈傷組織間生長素信號轉導途徑中的基因差異表達變化Fig.2 Auxin signal transduction pathway related-differentially expressed genes between EC subcultured by different concentrations of PIC in Agapanthus praecox

百子蓮實生苗幼葉取自上海交通大學農業與生物學院試驗田，液氮速凍后存于-80 ℃冰箱；Trizol試劑購于Invitrogen公司；SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit購于Clonetech公司；DH5-α感受態細胞購自Tiangen公司；SanPrep柱式DNA 膠回收試劑盒購自上海生工有限公司；pHB質粒購于Biovector中國質粒保存中心；Prime Script Reverse Transcriptase，EXTaqenzyme，LATaqenzyme，Prime Script Reverse Transcriptase，Oligo dT18，RNase inhibitor，DNaseⅠ，pMD18-T vector，SYBR Premix ExTaq等購于TaKaRa公司；引物由上海生工有限公司合成；測序由上海Invitrogen生物技術有限公司完成。

1.2 實驗方法

1.2.1ApARF與ApAux/IAA基因全長克隆

以百子蓮葉片為材料，利用Trizol試劑提取并純化總RNA[11]后采用Prime Script Reverse Transcriptase試劑盒進行反轉錄。以ApARF與ApAux/IAA基因核心片段序列為參考設計特異性引物(表1)進行PCR擴增，反應程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 3 min。產物經瓊脂糖電泳檢測回收后連接pMD18-T，轉化大腸埃希菌測序驗證核心序列的準確性，以其為依據設計3′-RACE與5′-RACE的特異性引物(表1)。按照購于TaKaRa公司的OligotexTM-dT30mRNA Purification Kit操作說明，運用百子蓮總RNA建立mRNA富集純化體系，按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit (Clontech)用戶手冊構建5′-與3′-RACE cDNA文庫。

按照SMARTerTMRACE用戶手冊分別配置ApARF與ApAux/IAA基因的3′， 5′-RACE第1輪PCR擴增體系，以RACE cDNA文庫為模板，采用通用引物(UPM)和特異性引物(3′， 5′-GSP1)擴增。程序為94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個循環；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個循環；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25個循環。3′，5′-RACE第2輪巢式PCR擴增體系以稀釋后的第一輪擴增產物為模板，利用NUP和3′， 5′-GSP2為引物，擴增程序為94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 3 min。

表1ApARF與ApAux/IAA基因擴增與RACE引物列表

Table1Sequences of primers for PCR ofApARFandApAux/IAA

引物堿基序列 (5'-3')退火溫度擴增目的PrimerSequenceAnnealingtemperature/℃PurposeUPMLongCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGT-GGTATCAACGCAGAGT70.3RACE擴增文庫接頭引物Adapter primers for RACE amplification libraryShortCTAATACGACTCACTATAGGGC58.2NUPAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT60.23'-GSP1-ARF1GGTTGAAATGACCGCAAAAGTGAGGC63.6ApARF1 3'-RACE3'-GSP2-ARF1GGTTGGGGAGTCATTTACACCGACGA65.15'-GSP1-ARF1ATCGTCGGTGTAAATGACTCCCCAAC63.6ApARF1 5'-RACE5'-GSP2-ARF1CCTGAGACTTGCTTGGGTTGTTGACA63.63'-GSP1-ARF2ATGGTAATGAATCAGAGACCGCCCCT63.6ApARF2 3'-RACE3'-GSP2-ARF2TAGCGAGTGGGACAAGGGTCAGCATA65.15'-GSP1-ARF2ATGCTGACCCTTGTCCCACTCGCTAC66.7ApARF2 5'-RACE5'-GSP2-ARF2TTTGGTCTAGGAACTGGAAGGGGGTT63.63'-GSP1-Aux/IAA2GGTCAAGGTCAACCACGCAGGAAAAT63.6ApAux/IAA2 3'-RACE3'-GSP2-Aux/IAA2GAGGACAAAGATGGGGATTGGATGCT63.65'-GSP1-Aux/IAA2AGCATCCAATCCCCATCTTTGTCCTC63.6ApAux/IAA2 5'-RACE5'-GSP2-Aux/IAA2GGTTGACCTTGACCGTCCTTGCTTTA63.63'-GSP1-Aux/IAA3AAGATGGAGGGTGTGGCAATAGGGAG65.1ApAux/IAA3 3'-RACE3'-GSP2-Aux/IAA3TTACGAGGATGAAGAAGGGGACTGGA63.65'-GSP1-Aux/IAA3TCCAGTCCCCTTCTTCATCCTCGTAA63.6ApAux/IAA3 5'-RACE5'-GSP2-Aux/IAA3CTCCCTATTGCCACACCCTCCATCTT65.1ARF1 senseATGCGTAATAACTGGTGTTG53.7ARF1 antisenseCATGTTCCCTTCATCGTC55.0ARF2 senseAGGCAAATGTTCCGTCTT52.7ARF2 antisenseTCCCTGCTTATGTACCTTAGTG58.2Aux/IAA2 senseAAGGCACAAGTTGTCGGA55.0核心片段克隆Aux/IAA2 antisenseTCCCCATCTTTGTCCTCA55.0Core fragment cloningAux/IAA3 senseGAGTTCGACCTCAACAACG57.6Aux/IAA3 antisenseCAACAAGCATCCAGTCCC57.3

瓊脂糖凝膠電泳檢測回收產物，連接pMD18-T vector載體進行測序，獲得4個目的基因的3′-和5′-端序列。

1.2.2 生物信息學分析

采用DNAMAN軟件拼接5′-RACE、3′-RACE與核心序列，獲得目的基因cDNA全長序列；NCBI ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)分析序列的CDS-ORF區，DNAMAN軟件對ORF區編碼的氨基酸序列進行翻譯。NCBI網站BlastP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對氨基酸序列，采用ClustalX軟件分析序列一致性和同源性。TAIR網站(http://www.arabidopsis.org/)下載擬南芥(Arabidopsisthaliana)中已知的23個ARF家族和29個AUX/IAA家族蛋白序列，運用MEGA 5.0軟件構建系統進化樹(neighbor-joining tree，Bootstrap=1 000)。應用SOPMA軟件對氨基酸二級結構進行預測分析。通過NCBI 的Conserved Domain Database數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，EMBI-EBI的Pfam 數據庫(http://pfam.xfam.org/)和PROSITE(http://prosite.expasy.org/)在線軟件對蛋白保守域進行分析[12-13]。利用ProtParam在線工具(http://expasy.org/tools/protparam.html)分析氨基酸的構成，MEME在線工具(http://meme-suite.org/tools/meme)對Aux/IAA蛋白的基序進行預測，輸入百子蓮與BLAST獲得的其他物種中的共12個Aux/IAA蛋白的序列，設定基序最大發現數目為4[14-15]。

1.2.3 基因過表達載體構建并轉化擬南芥

采用pHB質粒并選定PstⅠ和BamHⅠ為限制性酶切位點。拼接測序結果獲得基因全長序列后設計擴增引物(表2)，以百子蓮cDNA文庫為模板，在基因ORF片段的上下游分別引入BamHⅠ和PstⅠ酶切位點。反應程序為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 3 min。隨后采用酶切連接法構建載體，測序驗證載體構建成功后轉入農桿菌GV3101感受態，挑取農桿菌陽性單克隆經PCR檢測后，以花序浸染法侵染擬南芥。

1.2.4 轉基因擬南芥篩選鑒定及觀察

收獲的T1代種子播種后采用0.05%(V/V)草甘膦進行抗性篩選從而確定轉化成功后，選擇5～6個株系進行培育并收獲T2代種子。將T2代擬南芥種子與野生型(Columbia)種子經4 ℃春化后播種于穴盤中。在22 ℃，16 h/8 h(光照/黑暗)的人工氣候箱中培養，2周后對植株生長情況進行表型觀察。取表型差異明顯且穩定的轉基因株系葉片組織提取RNA并進行反轉錄(方法同前)，隨后采用qRT-PCR測定4個基因型T2代中目的基因的表達量。使用Beacon Design 7軟件設計qRT-PCR引物(表2)。反應程序為94 ℃ 10 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環。每個樣品進行3個重復，反應完成后采用2-ΔΔCt法進行數據分析，采用UBQ5作為內參基因(表2)。

2 結果與分析

2.1 ApARF與ApAux/IAA家族基因的全長序列獲得

獲得ApAux/IAA2、ApAux/IAA3、ApARF1、ApARF2的基因核心片段序列分別為330、474、921、1 617 bp；3′-端克隆序列長度分別為501、320、453、785 bp。5′-端第2輪巢式PCR擴增后，ApARF2基因出現了3個較明顯的條帶(圖3-D)，對各個條帶都進行回收和測序比對分析后，確定長度在1 000 bp以上的ApARF2擴增條帶為正確結果。最終獲得ApAux/IAA2，ApAux/IAA3，ApARF1，ApARF2的5′-端克隆序列長度分別為375、399、1 576、1 356 bp。

將5′-RACE與3′-RACE的測序結果與核心序列進行拼接后，獲得ApARF1、ApARF2、ApAux/IAA2、ApAux/IAA3基因的cDNA全長序列分別為2 343、2 888、1 034、821 bp；起始密碼子和終止密碼子分別位于256 nt/2 023 nt、200 nt/2 546 nt、105 nt/583 nt、77 nt/623 nt；各基因的5′非編碼區和3′非編碼區長度分別為255 bp/318 bp、199 bp/340 bp、104 bp/450 bp、76 bp/196 bp；CDS-ORF全長分別為1 770、2 349、480和549 bp；分別編碼589、782、159和182個氨基酸殘基，分子量分別為65.99、87.78、18.06、20.72 ku，pI分別為6.36、6.36、6.54和6.92(圖4)。

2.2 蛋白二級結構分析

蛋白二級結構分析表明(圖5)，ApARF1蛋白由31.24%的α-螺旋(alpha helix)，39.56%的隨機卷曲(random coil)，22.24%的延伸鏈(extended strand)和6.96%的β-轉角(beta turn)組成，其中α-螺旋與隨機卷曲占比最大；ApARF2蛋白由53.84%的隨機卷曲，20.84%的延伸鏈，19.44%的α-螺旋和5.88%的β-轉角組成，其中隨機卷曲占比最大。ApAux/IAA2蛋白由33.33%的延伸鏈，28.93%的α-螺旋，25.16%的隨機卷曲和12.58%的β-轉角組成，其中α-螺旋和延伸鏈占比最大；ApAux/IAA3蛋白由39.56%的隨機卷曲，25.82%的α-螺旋，22.53%的延伸鏈和12.09%的β-轉角組成，其中隨機卷曲和α-螺旋占比最大。四個蛋白中的α-螺旋、延伸鏈、β-轉角和隨機卷曲分布規律性不明顯。

表2ARF與Aux/IAA過表達載體構建與qRT-PCR檢測引物列表

Table2Sequences of primers for construction of over-expression vector and qRT-PCR ofApARFandApAux/IAA

引物名稱堿基序列(5'-3')引物名稱堿基序列(5'-3')PrimersSequencePrimersSequenceApARF1-RsATGGATCCATGGTGTTAGATGGTAAApARF1-RaTTACTGCAGTCAAGGTTGCAACTTCTApARF2-RsATGGATCC ATGGCGTCTCCTGAGGTApARF2-RaTTACTGCAGTCATGACTGGCTGTTGTApAux/IAA2-RsATGGATCCATGAGAGATCCAATGGAAGApAux/IAA2-RaTTACTGCAGTTACCCCCATGGAACATCApAux/IAA3-RsATGGATCCATGGAGCTAGAGTTAGGCCTApAux/IAA3-RaTTACTGCAGCTATGCAG-GTCTCTCTCGTTqT-F-ARF1TTCAGAGTCCATAGTTCCTTATqT-R-ARF1AACCTTGAGATGCTTCCAqT-F-ARF2ACTCAGATGGATTACTCACAAqT-R-ARF2GGCTCATAGGTAGGATTCAAqT-F-AUX2GACGATTGTGGTGTTGATqT-R-AUX2CCATTGGAGCAAGTTCTTqT-F-AUX3CAATAACCATATCGCCTATCCqT-R-AUX3ATCGTCCTCCTTGTCATCUBQ5-FGACGCTTCATCTCGTCCUBQ5-RCCACAGGTTGCGTTAG

A，3′-RACE第一輪擴增產物；B，3′-RACE第二輪巢式擴增產物；C，5′-RACE第一輪擴增產物；D，5′-RACE第二輪巢式擴增產物。M，DL2000 DNA marker。A， The first amplification of 3′-RACE; B， The second amplification of 3′-RACE; C， The first amplification of 5′-RACE; D， The second amplification of 5′-RACE. M， DL2000 DNA marker.圖3 3′，5′-RACE擴增產物電泳檢測圖譜Fig.3 Agarose gel electrophoresis of RACE products

圖5 百子蓮ApARF與ApAux/IAA蛋白二級結構特征Fig.5 Secondary structure prediction of ARF and Aux/IAA proteins in Agapanthus praecox

2.3 蛋白結構域分析

蛋白保守域分析結果表明，百子蓮ApARF1具有B3-DNA結合域(pfam02362)與Auxin_resp結構域(pfam06507，也稱ARF結構域)，位于氨基酸序列的113～212位與239～321位；ApARF2具有結構域B3-DNA，Auxin_resp與AUX_IAA(pfam02309)分別位于序列的141～242位，267～349位與665～737位。ApAux/IAA2與ApAux/IAA3均具有AUX_IAA 結構域(pfam02309)，位于氨基酸序列的21～159位和69～171位。

同時，ApAux/IAA與ApARF氨基酸序列都在C-端含有60～90 aa的PB1保守域(Phox and Bem1，PS51745)，且與ApAux/IAA2、ApAux/IAA3中的Aux/IAA結構域部分重合，與ApARF2中的Aux/IAA結構域基本完全重合(圖6)。

氨基酸數目統計結果表明，ApARF1與ApARF2中間區域均富含絲氨酸和脯氨酸(ApARF1: Pro7.9%，Ser 13.1%；ApARF2: Pro 10.6%，Ser 12.8%)。

圖6 百子蓮ARF 與AUX/IAA家族蛋白保守結構域Fig.6 Conserved protein domain of ARF and Aux/IAA protein in Agapanthus praecox

基序分析獲得4個基序，長度分別為21，41，50，29個氨基酸，對應Aux/IAA蛋白中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ結構域(圖7)。分析結果表明，百子蓮Aux/IAA 2蛋白具有4個結構域，其中Ⅳ結構不完整；百子蓮Aux/IAA 3蛋白具有Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ結構域，而結構域Ⅱ保守性低(圖8)。

2.4 氨基酸序列同源性分析

BlastP分析表明，ApARF1與ApARF2基因編碼的氨基酸序列與多種其他植物中的ARF蛋白具有較高的同源性，為50%以上(圖8)。其中，與ApARF1氨基酸序列同源性最高的是油棕(ElaeisguineensisARF 24-like)，同源性為65%；與海棗(PhoenixdactyliferaARF 24-like isoform X2)的同源性為64%。與ApARF2氨基酸序列同源性最高的是油棕(ElaeisguineensisARF 4-like)，同源性為65%；其次是荷花(NelumbonuciferasARF 2-like)，同源性為62%。

ApAux/IAA2與ApAux/IAA3編碼的氨基酸序列同樣與其他植物中的Aux/IAA家族蛋白具有較高的同源性，為50%以上(圖9)。與百子蓮ApAux/IAA2氨基酸序列同源性最高的是海棗(PhoenixdactyliferaAUX 22D-like 8132)，同源性為61%，其次是油棕(ElaeisguineensisAUX 22D-like 3480)，同源性為60%。與ApAux/IAA3氨基酸序列同源性最高的是鳳梨(AnanascomosusAux IAA20)，同源性為60%，其次是小果野蕉(Musaacuminatasubsp.MalaccensisAux IAA9-like X1)，同源性為55%。

方框圈定的區域為圖9中標注的保守結構域的序列。Positions of conserved domains displayed in Fig.9 were boxed.圖7 Aux/IAA家族蛋白4個基序Fig.7 Four motifs distribution of 12 Aux/IAA proteins

Asparagus officinalis ARF 2-LIKE isoform X2(XP_020274070.1)，Asparagus officinalis ARF 2-LIKE isoform X1(XP_020274069.1)，Asparagus officinalis ARF 23-LIKE isoform X3(XP_020274071.1)，Phoenix dactylifera ARF 24-like isoform X2(XP_008813740.1)，Elaeis guineensis ARF 24-like isoform X2(XP_010914409.1)；Nelumbo nucifera ARF 2-like(XP_010249209.1)，Elaeis guineensis ARF4-like(XP_010926858.1)，Asparagus officinalis ARF 2-like X1(XP_020261175.1)，Asparagus officinalis ARF 2-like X2 (XP_020261177.1)，Asparagus officinalis ARF 2-like(XP_020248955.1).圖8 ApARF1與ApARF2氨基酸序列同源性比對Fig.8 Multiple sequence alignment of ARF in Agapanthus praecox and other plants

Phoenix dactylifera AUX 22D-like 8132(XP_008788132.1)，Elaeis guineensis AUX 22D-like 3480(XP_010923480.1)，Elaeis guineensis AUX 22D 6161(XP_010936161.1)，Asparagus officinalis AUX 22D-like 4650(XP_020274650.1)，Asparagus officinalis A4U43 4425(ONK64425.1)，Elaeis guineensis Aux IAA20 X2(XP_010904976.1)，Phoenix dactylifera Aux IAA9-like X5 (XP_008809248.1)，Musa acuminata subsp. malaccensis Aux IAA9 X1(XP_009419087.1)，Asparagus officinalis AuxIAA20-like(XP_020244002.1)，Ananas comosus Aux IAA20 (OAY64285.1).圖9 ApAux/IAA2與ApAux/IAA3氨基酸序列同源性比對Fig.9 Multiple sequence alignment of Aux/IAA in Agapanthus praecox and other plants

2.5 系統進化樹分析

植物ARF與Aux/IAA家族蛋白成員眾多，已經在多種草本和木本植物中被分析研究[4]，其表達特征也比較復雜[7,16]。因此采用擬南芥(Arabidopsisthaliana)中研究較為深入的23個ARF和29個Aux/IAA家族蛋白[17]分別與ApARF1、ApARF2及ApAux/IAA2、ApAux/IAA3蛋白構建系統進化樹，分析蛋白在生長素調控途徑中的作用和潛在的相互作用機制。

系統進化樹分析結果(圖10)表明，ARF家族蛋白在系統進化樹中聚合成4類，其中ApARF1與AtARF1(AT1G59750)聚合，ApARF2與AtARF2(AT5G62000)聚合，4個蛋白均在同一聚類中。ApAux/IAA2與AtIAA1(AT4G14560)、AtIAA2(AT3G23030)、AtIAA3(AT1G04240)、AtIAA4(AT5G43700.1)聚合成一簇，與AtIAA4的親緣關系最近；ApAux/IAA3與AtIAA29(AT4G32280)、AtIAA20(AT2G46990)、AtIAA30(AT3G62100)、AtIAA31(AT3G17600)聚合為一簇。

2.6 轉基因植株功能驗證

基因熒光定量實驗表明，在ApARF1、ApARF2、ApAux/IAA2和ApAux/IAA3過表達擬南芥中，目的基因的表達量分別是內參基因UBQ5的2.6、3.6、3.4和3.2倍，而在野生型植株中均未見表達(圖11)。

表型比對結果表明，ApARF1與ApARF2轉基因植株的生長速度均明顯快于野生型(圖11-C、D)，可見ApARF1與ApAPF2正向調控植株的開花成熟及生長過程。ApAux/IAA2和ApAux/IAA3轉基因擬南芥植株矮小，生長速度則明顯慢于野生型，發育受到阻遏，說明ApAux/IAA2和ApAux/IAA3基因對于植物的生長存在負調控作用(圖11-G、H)。

3 討論

目前已在植物中發現眾多ARF與Aux/IAA家族蛋白成員。Aux/IAA在大豆(Glycinemax)、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)[16]、馬尾松(Pinusmassoniana)[18]；ARF在水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、番茄(Solanumlycopersicum)、大豆(Glycinemax)、油菜(Brassicanapus)、葡萄(Vitisvinifera)[4]等植物中被發現和分析。

左為Aux/IAA家族，右為ARF家族。Bootstrap=1 000。Neighbor-joining bootstrap phylogenetic trees of ARFs (left) and Aux/IAAs (right) from Arabidopsis thaliana and Agapanthus praecox. The bootstrap was 1 000.圖10 ApAux/IAA與ApARF家族蛋白系統進化樹Fig.10 Phylogenetic analysis of Aux/IAA and ARF proteins

A，ApARF1基因相對表達量；B，ApARF1轉基因擬南芥表型；C，ApARF2基因相對表達量；D，ApARF2轉基因擬南芥表型；E，ApAux/IAA2基因相對表達量；F，ApAux/IAA2轉基因擬南芥表型；G，ApAux/IAA3基因相對表達量；H，ApAux/IAA3轉基因擬南芥表型；虛線表示內參基因UBQ5表達量。A， Relative gene expression of ApARF1; B， Phenotype of ApARF1 over-expression Arabidopsis thaliana; C， Relative gene expression of ApARF2; D， Phenotype of ApARF2 over-expression Arabidopsis thaliana; E， Relative gene expression of ApAux/IAA2; F， Phenotype of ApAux/IAA2 over-expression Arabidopsis thaliana; G， Relative gene expression of ApAux/IAA3; H， Phenotype of ApAux/IAA3 over-expression Arabidopsis thaliana. The dotted line indicated the expression of reference gene UBQ5.圖11 ApARF和ApAux/IAA轉基因擬南芥植株qRT-PCR檢測結果與生長表型Fig.11 qRT-PCR detection and phenotype observation of ApARF and ApAux/IAA genes in wild type and transgenic over-expression Arabidopsis thaliana

本研究通過RACE技術獲得百子蓮中2個Aux/IAA基因和2個ARF基因的全長，并對各個基因所編碼的蛋白進行分析。在蛋白結構域組成上，ApARF2符合典型的ARF家族蛋白構造，具有N-端的B3-like DNA結合域，C-端Aux_IAA結構域和中間區域[4，7]；ApARF1缺失C-端負責形成ARF、Aux/IAA間同源/異源二聚體的AUX_IAA結構域，但具有PB1保守域(圖6)。PB1結構域能夠介導蛋白間異源或同源聚化[19]，如擬南芥AtARF17蛋白，雖缺失C端的保守域，但仍能夠與Aux/IAA蛋白互作[9,13]，序列分析表明其具有PB1結構域，可見其起到了代替C端的AUX_IAA結構域的作用。系統進化樹的聚合結果(圖10)表明，ApARF1、ApARF2與轉錄抑制因子AtARF1、AtARF2聚合。百子蓮ApARF1、ApARF2的中間結構域都富含絲氨酸與脯氨酸，也表明其應具有轉錄抑制功能，在植物中功能類似AtARF1與AtARF2，通過抑制植物細胞分裂相關基因的轉錄來正向調節葉片的衰老、花脫落、角果成熟等相關生理過程[8,12,20]。轉基因表型實驗也初步驗證了二者與植株生長成熟過程相關的推測。

百子蓮ApAux/IAA2蛋白具有完整的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ結構域，雖蛋白互作相關結構Ⅳ結構域不完整，但因具有PB1保守域，應仍具有形成蛋白二聚體的功能。系統進化樹中(圖10)，ApAux/IAA2與具有完整結構的AtAux/IAA1和AtAux/IAA3蛋白功能相近，應能與ARF家族蛋白互作并響應生長素信號，負調節生長素響應因子，抑制植株的地上部分或根系的生長[21-22]。ApAux/IAA2基因過表達植株出現的生長延緩表型特征初步驗證了這一推測。百子蓮ApAux/IAA3蛋白具有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ結構域，結構域Ⅱ不完整(圖8)。系統進化樹中與其聚合的蛋白中，AtIAA31、AtIAA20、AtIAA30、AtIAA29也缺失結構域Ⅱ[15-16]。結構域Ⅱ的缺失會使IAA蛋白更加穩定且難以被降解，進而抑制ARF轉錄活性從而影響相關生長素介導的發育過程[23]，如AtIAA31蛋白，穩定性高于典型Aux/IAA蛋白，基因過表達可能造成植株矮化等生長素缺陷表型[24]，與ApAux/IAA3基因過表達植株的表型相一致。此外，AtIAA30蛋白具有促進體細胞胚胎的發生的功能[24]，ApAux/IAA3也可能具有類似的調控作用。

本研究對百子蓮Aux/IAA家族和ARF家族蛋白在體胚誘導和生長素信號轉導中的作用進行分析，并通過基因克隆、蛋白結構和功能驗證，為進一步探究植物細胞胚性誘導和構建體胚體系提供理論指導。目前對于ARF與Aux/IAA家族蛋白在植物體內的功能研究表明，ARF與Aux/IAA之間的同源或異源二聚體化與它們在生長素信號調控過程中發揮的生理功能緊密相關[9]。為進一步驗證百子蓮ARF與Aux/IAA蛋白之間的互作和相互調節，在后續實驗中可通過酵母雙雜實驗檢驗百子蓮ApARF與ApAux/IAA蛋白之間是否存在直接對應的相互作用，并通過酵母單雜交方式研究ARF蛋白是否對通過結合Aux/IAA上游的元件激活并調節基因的表達，從而進一步揭示ARF與Aux/IAA在觀賞植物生長素信號傳導過程中的調控作用。