鳶尾聯合固定化菌劑凈化河道水體的微生態過程

劉宗楠，王 新，吳逸飛，姚曉紅，孫 宏，沈 琦，李維琳，湯江武，*

(1.華中農業大學 生命科學與技術學院，湖北 武漢 430070； 2.浙江省農業科學院 植物保護與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

隨著城市化、工業化進程加快，以及現代農業的發展，我國水環境污染日益嚴重，水體生態系統遭到不同程度的破壞。氮、磷是引起水體污染和富營養化的主要物質，會導致水體水質和生態系統變化，并影響水體功能[1]。污染水體的修復和治理技術研究是當前的熱點領域，其中，生物修復技術因具有環境友好、生態節能的優點，受到廣泛重視。水生植物能通過自身同化降低水體中N、P濃度，促進水體營養的輸出，有效調控水生態系統的物質循環和能量流動，因此，恢復水生植被是控制水體富營養化的一種重要的生態方法。在污染嚴重的水體中，常采用生態浮島的方式構建水生植被來凈化水體[2-5]。水環境中污染物的轉化和去除，更多地依賴于微生物的作用。微生物用于污染水體的原位修復，在國內已經有不少成功的例子，如上海上澳塘、綏寧河、蘇州河，廣州朝陽涌，昆明西壩河，東莞珊洲河、萬江，北京大觀園中心湖，桂林桃花江等[6-8]。微生物固定化技術的發展，可顯著提高功能微生物的沉降性能，提高水質凈化效率， 在原位應用中可有效解決微生物的流失問題，還具有抗環境因子影響、使用成本低廉等諸多優點[9-11]。然而，在實際應用中，當前基于生態浮島的植物修復技術存在可靠性不穩定、不同地域污染水體處理效果差異大、受季節影響大等問題，與其他生態修復技術，如微生物強化修復、碳纖維生態基等的耦合，是提升其作用效果的有效途徑，也符合水環境治理技術綜合性、系統性發展的趨勢。近年來，植物-微生物聯合處理污水的研究受到重視[12-13]，但總體來說，相關研究主要集中在植物-微生物聯合處理污染水體的作用效果方面，對其在水體中的相互作用過程，以及對水體微生態環境變化的影響知之甚少，勢必會影響植物、微生物這兩種生物修復技術的有效結合和綜合應用。本文以鳶尾為研究對象，通過其與固定化凈水菌劑共同作用處理河道污水的實驗研究，探索水體凈化過程中水體功能微生物群落的變化，分析植物-微生物的相互作用和耦合效應，為污染水體生物修復技術的發展和綜合應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗水樣來源及實驗方法

實驗用水樣采集自杭州市城郊河道(120°20′48″E，30°31′65″N)，水體氨氮含量約4.7 mg·L-1，化學需氧量(CODMn)約為17.0 mg·L-1。水樣分裝在特制的實驗裝置中，中間為布水槽，兩側為實驗槽，包括布水槽在內，均等分為5個實驗容積約80 L的單獨水槽，每個實驗水槽外側靠近頂部設置出水口，和布水槽相連的內側底部為進水口，布水槽之間的隔斷低于實驗槽外側的出水口。實驗所用植物材料為白花鳶尾(Iristectorumf.alba)，用實驗河水經過一段時間的培養后，選取生長狀況良好、長度差異在2 cm以內的植株備用。實驗分為鳶尾(YW)、鳶尾+固定化凈水菌(YWB)、固定化凈水菌(CKB)、空白對照(CK)4個實驗組，其中，YW和YWB組設置3個平行樣，CKB和CK組設置2個平行樣。含有植物的樣品，每個植入3株，培養7 d后，用網袋裝入20 g固定化凈水菌，固定在鳶尾的根部，開始實驗。每天用于流加的河道污水提前抽入大容量水桶中，調控水體氨氮在(4.2±0.5) mg·L-1，從實驗裝置的中間槽流加河道污水，控制進水量，使河道污水在實驗裝置中的停留時間約為10 h。實驗環境溫度為自然溫度(14～18 ℃)，實驗開始后在進水端采集原始水樣，隨后每天在各實驗槽的出水段采集水樣，測定水質參數，并隔天采集、保存分子樣品(共采集6次)，用于微生物群落結構和多樣性分析。

1.2 固定化凈水菌的制備

實驗所用菌株AOZ1(Enterobactersp.)和BSK9(Bacillussubtilis)分別具有氨氧化和COD降解功能，由浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所環境微生物研究室分離篩選并保藏，菌劑經LB液體培養基發酵后離心，獲取菌泥，用于固定化凈水菌劑的制備，方法如下：配制4%海藻酸鈉水溶液100 g，混勻后水浴加熱，維持在60 ℃，加入硅藻土50 g攪拌均勻，冷卻至50 ℃以下加入菌劑，進一步混合倒入模具，自然冷卻成型后浸入4% CaCl2水溶液中固化過夜，最后用去離子水洗凈瀝干備用[10]。采用該方法制備的固定化凈水菌，載菌量約1.32×1011g-1，15 d平均釋放量約為5.41×106g-1·d-1。

1.3 水樣細菌總DNA的提取

采集50 mL水樣，用0.22 μm微孔濾膜過濾收集菌體，濾膜用鋁箔包裹，液氮速凍后存于-20 ℃冰箱備用。提取DNA時，將收集了大量菌體的濾膜剪成碎片，然后采用MOBIO PowerWater?DNA Isolation Kit，參照試劑盒附帶的操作步驟，提取樣品中的DNA。獲得的DNA用Nanodrop 2000檢測后，存于-20 ℃冰箱備用。

1.4 細菌16S rDNA、氨氧化和反硝化功能基因擴增和高通量測序

提取獲得的水樣總DNA送交杭州利貞生物醫藥科技有限公司，PCR擴增細菌16S rDNA、氨氧化和反硝化功能基因片段，PCR產物經定量和均一化后，制備MiSeq PE文庫，采用Illumina PE250平臺進行高通量測序。用于PCR的引物，含barcode序列。用于細菌16S rDNA基因擴增的引物為：515F，5′-barcode-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′；907R，5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′[14]。用于氨氧化功能基因擴增的引物為：amoB-1Fmod，5′-barcode-CTGGGGTTTCTACTGGTGGTC-3′；GenAOBR，5′-GCAGTGATCATCCAGTTGCG-3′[15]。用于反硝化功能基因nirS擴增的引物為：Cd3aF24，5′-barcode-GTSAACGTSAAGGARACSGG-3′；R3cd101，5′-GASTTCGGRTGSGTCTTGA-3′[16]。PCR為20 μL反應體系，采用TransStartFastpfuDNA Polymerase。16S rDNA基因反應條件為：95 ℃變性240 s；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，27 個循環；最后72 ℃延伸10 min。氨氧化功能基因反應條件為：98 ℃變性2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 45 s，27 個循環；最后72 ℃延伸10 min。反硝化功能基因反應條件為：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，27個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物經定量和Miseq文庫構建后，上機進行高通量測序。

1.5 測序數據分析

測序獲得數據，參考文獻[17-18]提及的方法進行處理，利用Uparse version 7.1(http://qiime.org/)軟件平臺進行操作分類單元(OTU)聚類，采用RDP classifier對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并在各個水平上統計每個樣品的群落組成。在QIIME中調用blast方法與序列數據庫Greengene(http：//greengenes.secondgenome.com)進行16S rDNA比對，在FGR(http://fungene.cme.msu.edu/)中進行功能基因比對，獲得每個OUT代表序列的分類學信息。利用Mothur軟件做稀釋性曲線分析， 用香農指數(Shannon)計算細菌生態多樣性指數，用Origin 9.5制作群落結構組分圖，用R語言做主坐標分析。

1.6 分析方法

水樣中氨氮含量參照HJ 536—2009進行測定，總有機碳(TOC)、總氮(TN)采用耶拿MULTIN/C 3100型測定儀測定，COD采用重鉻酸鉀比色法測定，溫度與溶解氧(DO)采用梅特勒SG98型溶氧儀直接測定。各項水質指標的測定，均為3個平行樣品。

1.7 數據分析

采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析，對有顯著差異(P<0.05)的處理采用Tukey法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 對河道污水的凈化效果

實驗流加的河道污水氨氮含量為(4.2±0.5) mg·L-1，總氮濃度為(4.8±0.5) mg·L-1，COD為(20.0±0.5) mg·L-1。實驗開始后，進行連續采樣檢測，環境溫度在14～18 ℃。測定結果顯示，平均溶氧YW組為8.0 mg·L-1，高于YWB組的7.7 mg·L-1，CKB組為9.4 mg·L-1，稍高于CK組的9.3 mg·L-1。

河道污水的動態流加使進水水質穩定在一定范圍內，在實驗裝置中經過約10 h的停留后，出水水質發生變化。各個實驗組出水中氨氮均呈下降趨勢，在6 d之后基本穩定，表明整個裝置運行處于穩定狀態。CK組的氨氮變化趨勢與其他實驗組基本相同，也呈下降趨勢，這與水體中本身存在的微生物的作用有關。YW、YWB、CKB組出水中的氨氮均顯著(P<0.05)低于空白對照組，但YW和YWB組之間差異不顯著。

出水的總氮在4.97～6.50 mg·L-1，這可能與進水總氮的波動有關，除第2、7、8天外，各實驗組總氮含量沒有顯著差異。整個實驗系統內總氮的去除效率較低，這可能與實驗體系內溶氧較高有關。

各實驗組出水中TOC均呈下降趨勢，在3 d之后基本穩定，顯示整個裝置對TOC的去除有一定的作用，但各實驗組之間的差異不顯著。

各實驗組出水的COD在7.75～19.0 mg·L-1波動，各實驗組的變化趨勢基本相同，組間沒有顯著差異，整體對COD的去除效率較低。

2.2 凈水過程中水體細菌群落組成和多樣性

采用高通量測序分析實驗過程中水體細菌的群落組成和多樣性。樣品測序序列數多于65 718條，以隨機抽到的序列數及其對應的OTU種類繪制稀釋性曲線，結果表明，測序深度能夠真實反映樣品中優勢細菌的數量關系。以97%相似性水平為標準劃分OTU，在24個樣本中共獲得6 763個OUT，各樣品的OTU數量在1 663～2 833，分別對應CK組第2次樣品(CK2，下列標記方法同)和YWB3。通過樣品測序序列計算各樣品的香農指數，最高值為YW2的5.88，最低值為YW5的4.68，除了YW組外，其他各樣品的多樣性變化不大。

對全部樣品獲得的OUT進行注釋，結果顯示，樣品細菌主要集中在變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、藍藻菌門(Cyanobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、軟壁菌門(Tenericutes)、螺旋菌門(Spirochaetae)等10個菌門。各個樣品中，變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門、藍藻菌門的含量合計，除YW2(86.0%)、YW4(88.0%)和YWB2(84.6%)外，均超過91.7%，說明整個體系細菌種類在門的水平比較穩定。在屬的水平上，相對豐度較高的OUT分屬67個屬(圖2)，其中，擬桿菌屬(Bacterioides)、叢毛單胞菌屬(Comamonadaceae)、藍細菌屬(Cyanobacteria)、黃質菌屬(Flavobacterium)、Malikia、Limnohabitans、Pseudarcicella、新鞘氨醇菌屬(Novosphingobium)、厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)、紅桿菌屬(Rhodobacteraceae)、Faecalibaculum等屬在細菌群落組成中占有較高比例。因相對豐度較低，歸入“其他”類別(others)的屬，在不同樣品中的總相對豐度在23.0%～32.3%，表明實驗水樣中具有較高的細菌多樣性。

圖1 動態實驗中水體氨氮、總氮、TOC和COD的變化Fig.1 Variation of ammonia nitrogen， total nitrogen， total organic carbon and chemical oxygen demand

分析不同時間不同組樣品群落組成的差異，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)之和為71.37%(圖3)。各實驗組在實驗開始時水體的細菌群落結構具有較高相似性，這與實驗起始階段各實驗組水體細菌群落尚未發生顯著變化相一致。隨后各個實驗組的細菌群落開始發生變化，其中，YW組水體細菌群落在3～11 d聚在一起，顯示鳶尾的生長可能對水體的細菌群落結構穩定有一定作用。YWB組和其他實驗組一樣，細菌群落結構在3～11 d呈現顯著變化，表明固定化微生物的釋放，對實驗水體細菌群落結構產生較大的影響。除YW組外，其他組水樣細菌群落結構從第9天開始趨同，而YW組在第11天也與其他各組水體的細菌群落結構相近，表明動態實驗過程中，水體細菌群落有一個動態的變化過程，這個過程也可能是水體微生物功能發生變化的過程。

圖2 水樣中主要細菌在屬水平上的相對豐度Fig.2 Relative abundance of dominant bacteria at genus level in water samples in different time

圖3 水樣中細菌群落結構的主坐標分析Fig.3 Principal coordinate analysis from bacterial 16S rDNA gene sequences

2.3 凈水過程中水體功能微生物群落組成和多樣性

以amoB基因為分子標記，分析實驗過程中水體氨氧化細菌的群落組成和多樣性。樣品測序序列數多于53 925條，稀釋性曲線表明，測序深度能夠真實反映樣品中優勢菌的數量關系。以97%相似性水平為標準劃分OTU，24個樣本的OTU數量在138(YW3)～544(CK1)。通過樣品測序序列計算各樣品的香農指數，最高值為1.53(CK5)，最低值0.83(YW3)。除了YW6和CKB3外，其他各樣品的多樣性變化不大。對amoB基因測序獲得的OUT進行注釋，結果顯示，24個樣品中具有amoB基因的細菌98.3%以上主要集中在變形菌門和未分類的細菌中，其中，CK3、CK6、CKB2、YW3、YW4、YWB2、YWB3、YWB6以未分類細菌為主，相對豐度在98.3%～99.7%。在屬的水平上，99.35%～99.96%的屬存在于未能分類的細菌以及變形菌門各屬中，僅有較低豐度的細菌存在于已知的氨氧化細菌種屬，如Nitrosomonadaceae(unclassified)、Nitrosomonadales(unclassified)、Nitrosospira、Nitrosovibrio中。

以nirS基因為分子標記，分析實驗過程中水體反硝化微生物的群落組成和多樣性。樣品測序序列數多于73 630條，稀釋性曲線表明，測序深度能夠真實反映樣品中優勢菌的數量關系。以97%相似性水平為標準劃分OTU，24個樣本的OTU數量在38(CK4)～115(YW2)。通過樣品測序序列計算各樣品的香農指數，最高值為2.85(CKB1)，最低值1.94(YWB4)，其他各樣品的多樣性變化不大。對nirS基因測序獲得的OUT進行注釋，結果顯示，24個樣品中具有nirS基因的細菌96.1%以上主要集中在變形菌門(相對豐度68.2%～90.3%)和未分類的細菌中。在屬的水平上，相對豐度較高的OUT分屬6個屬(圖4)，分別為Proteobacteria(unclassified)、Bacteria(unclassified)、動膠菌屬(Zoogloea)、脫氯單胞菌(Dechloromonas)、紅環菌科(Rhodocyclaceae_unclassified)、Betaproteobacteria(unclassified)。除未分類的屬外，“其他”類別(others)也是反硝化細菌常見的種屬。

通過主坐標分析法分析不同組樣品反硝化功能微生物群落組成的差異，第一主成分和第二主成分之和為69.79%(圖5)。結果顯示，各實驗組的反硝化微生物群落結構在不同分組之間不能有效分開，表明它們之間的差異總體不大。但與起始相比，各實驗組反硝化微生物群落結構均發生了顯著變化，這表明動態實驗過程中，盡管受到不同處理因素的影響，水體反硝化微生物群落仍具有一定的穩定性。

3 討論

本實驗顯示，鳶尾與固定化菌劑在動態模擬實驗中對河道污水中的氨氮和TOC具有穩定的去除作用。在凈水過程中，水體細菌群落發生動態變化并最終趨同。鳶尾與固定化菌劑對水體反硝化功能微生物群落存在一定的影響，且表現為一定的協同作用，但固定化凈水菌的作用強于鳶尾。

水環境治理的科技發展逐漸從單向治理走向綜合治理，作為常用的有效生物修復技術，植物和微生物修復技術在實踐中已經得到了廣泛的應用[3-4，12，19]，將兩者結合在一起，優勢互補，形成綜合的水體修復技術，是未來的發展方向。通常認為，除了對無機污染物的直接吸收外，水生植物根系微環境形成的根際微生物群落，對水體污染物的去除也具有重要作用，這是植物和微生物聯合應用于污染水體修復的基礎[20]。已有不少研究關注植物-微生物結合用于水體修復的效果[12-13]，以及水生植物根際微生物的群落結構和多樣性[21-22]，試圖探索植物影響水體微生物，進而影響水體凈化的過程和機理[23]，但相關研究仍遠遠不足，無法解釋并解決植物修復技術存在的效果不穩定、環境因素影響大等問題。水體污染物的降解和轉化，主要依賴于微生物的作用[24]，植物或微生物在水體應用過程中，與土著微生物之間的相互作用必然會影響水體微生態，并由此引起一系列的生態效應。本研究通過動態的河道污水流加，模擬了原位水體的交換過程，對水體主要水質指標的監測結果表明，整個系統在運行過程中存在一個變化到穩定的過程，相對于進水來說，整個模擬系統具有穩定的污染物去除效果。與之相對應，水體細菌群落結構亦處于動態的變化過程中，并最終趨同。細菌群落結構的變化必然引起其生態功能的變化[24]，這也是進出水差異的重要原因。

圖4 水樣中反硝化細菌在屬水平上的相對豐度Fig.4 Relative abundance of dominant denitrifying bacteria at genus level in water samples at different time

圖5 水樣中反硝化細菌群落結構的主坐標分析Fig.5 Principal coordinate analysis from nirS gene sequences

鳶尾組的細菌群落結構變化顯著異于其他各組的變化，顯示其對水體細菌群落結構具有重要影響，既有研究[13，21]也有類似的結論。固定化凈水菌在水體中是緩釋過程，對水體細菌群落有顯著影響[10]。在根部添加固定化凈水菌的鳶尾組，細菌群落結構的變化更接近于只加固定化凈水菌的實驗組，說明固定化凈水菌對水體細菌群落的影響大于鳶尾的影響。與此同時，鳶尾和固定化凈水菌對水體細菌群落的影響存在一定的協同作用。

實驗水體是當前區域典型的氮污染水體，對氨氧化和反硝化功能基因的高通量測序分析結果表明，體系中這些功能微生物的群落結構和多樣性變化相對于總細菌較小。具有氨氧化功能基因的微生物主要集中在變形菌門和未分類的細菌中，而已知的氨氧化細菌種屬的相對豐度極低，因而群落結構的變化也較小。這既可能是由于系統運行時間還未能滿足氨氧化功能微生物的生長需求，也可能與本實驗采用的功能基因測序分析技術手段有關。具有反硝化功能的微生物集中在變形菌門，其群落結構相較于初始階段有一定變化，但保持了一定程度的穩定，這可能與實驗生境溶氧較高、反硝化微生物活性不高有關。