經頭孢他啶誘導產生亞胺培南耐藥的銅綠假單胞菌的耐藥表型及其耐藥機制研究

蔣逸 ，沈佳麗 ，蔣文玥 ，史偉峰

（1.蘇州大學附屬第三醫院，江蘇 常州 213003；2.常州市武進人民醫院，江蘇 常州 213161）

0 引言

銅綠假單胞菌是醫院感染的常見病原菌之一，也是免疫功能低下、嚴重創傷、長期住院患者合并感染的常見病原菌，可引起呼吸科、燒傷科、重癥監護病房等病區的暴發流行[1]。對于銅綠假x單胞菌的感染，臨床常規選擇三代頭孢菌素作為經驗用藥，但在治療過程中極易出現耐藥，增加臨床治療難度。因此研究頭孢他啶誘導銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）產生亞胺培南（Imipenem,IMP）耐藥的機制具有十分重要的臨床意義。本研究以抗菌藥物全敏的PA臨床分離株為初始菌株，人工誘導使其產生IMP耐藥性，檢測誘導耐藥株碳青霉烯酶、ESBLs、AmpC酶、整合酶、膜孔蛋白oprD2及主動外排系統等耐藥表型的變化，旨在為進一步研究其耐藥的分子機制奠定基礎，并為臨床合理用藥，有效治療PA感染提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

20株銅綠假單胞菌敏感菌株均收集自我院2016年7月-12月住院病人標本，標本種類包括痰、血、分泌物、中段尿、咽拭子等，初篩藥敏實驗由Vitek2Compact及BD Phonenix100全自動細菌鑒定儀完成，受試菌株對常規監測的11種抗菌藥物均為敏感，包括阿米卡星（AMK）、環丙沙星（CIP）、左旋氧氟沙星（LEV）、氨曲南（ATM）、頭孢他啶（CAZ）、頭孢吡肟（FEP）、亞胺培南（IPM）、美洛培南（MEM）、哌拉西林（PIP）、哌拉西林/他唑巴坦（TZP）、慶大霉素（GEN）。質控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853，藥敏判斷標準為CLSI2017版。

1.2 主要試劑耗材

頭孢他啶藥敏紙片，亞胺培南紙片（10ug/L）均購自Oxoid公司，頭孢他啶藥敏粉劑購自海南海靈化學制藥有限公司。細菌DNA提取試劑盒；細菌總RNA快速抽提試劑盒；M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒；PCR上下游引物；DNA Marker 100bp；瓊脂糖；澳化乙錠（EB）；異丙醇：均購自上海生工生物工程公司。PCR檢測試劑盒：TAKARA公司。SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）：TaKaRa公司。

1.3 主要儀器和儀器

全自動藥敏分析儀Vitek 2 Compact及BD Phonenix100。-70℃低溫冰箱：Thermo公司。二氧化碳培養箱：日本SANYO公司。PCR儀器：Thermo公司。熒光定量PCR儀：MyGoPro。

1.4 方法

1.4.1 全敏PA菌株的篩選

采用全自動藥敏分析儀Vitek2Compact及BD Phonenix100對臨床分離菌株進行鑒定和藥敏試驗，并用Whonet5.6軟件對數據進行統計分析，將鑒定為抗菌藥物全敏的PA分離株，記錄其來源病例信息，挑取各菌株單菌落進行增菌培養，用微孔稀釋法測定其最小抑菌濃度（MIC），根據美國臨床實驗室標準化研究所（CLSI）2017年版標準規定的臨界值判定耐藥、中介和敏感。

1.4.2 多步法誘導耐藥菌株

在12×8孔培養板種加入含相應濃度的頭孢他啶-MH肉湯，然后加入受試菌液，使最終的菌液濃度為105CFU/mL，初始誘導濃度為1/4MIC，依次2倍遞增，即1/2MIC、MIC、2MIC、4MIC，每個藥物濃度培養5代，當生長不良時可延長培養時間或降低藥物濃度重復傳代培養，每5代測定頭孢他啶的MIC值，記為 MIC1、MIC2、MIC3、MIC4、MIC5，誘導時間持續25代，完成誘導后收集菌株，用全自動細菌鑒定儀鑒定并觀察耐藥情況。

1.4.3 細菌處理

將全自動細菌鑒定儀篩選出來的耐亞胺培南的誘導株，用K-B法進行確認，結果判讀標準為美國臨床及實驗室標準協會（CLSI）2017年標準。儀器法和K-B法亞胺培南均為耐藥者入選。取1mL過夜培養的細菌菌液，按照細菌基因組DNA快速抽提試劑盒的標準操作程序提取細菌DNA，作為PCR模板，提取完成后置-20℃備用。

1.4.4 基因檢測

PCR法分別擴增銅綠假單胞菌5種金屬β-內酰胺酶（MBLs）基因IMP、VIM、SIM、GIM、SPM和7種超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）基因TEM、VEB、SHV、PER、OXA-2以 及 OXA-10，2種 AmpC酶 基 因 PDC、DHA，3種整合酶基因intIl、intI2和intI3。引物序列與退火溫度見表1。PCR擴增體系采用50ul體系，具體如下：TE buffer 5ul，dNTP 4ul,上、下游引物各1ul，Taq酶0.25ul，DNA模板2ul，ddH2O補足體系。PCR擴增條件：金屬酶類，94℃預變性5min，94℃30s，退火30s，72℃延伸60s，共35個循環，最后72℃延伸7min。超廣譜β-內酰胺酶和整合酶，AmpC酶：擴增產物＞500bp，93℃預變性5min，然后94℃60s，55℃退火60s，72℃延伸60s，共35個循環，最后72℃延伸5min；PCR產物＜500bp，93℃預變性5min，然后93℃30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環，最后72℃延伸5min。PCR擴增產物加入10ul6×DNA loading buffer，經瓊脂糖凝膠電泳，120mV電泳30-40min，紫外燈下觀察結果，出現目的條帶即認為陽性，拍照保存。

1.4.5 基因測序

PCR擴增產物送上海生物工程有限公司進行測序，應用GenBank在線數據庫對比工具BLAST進行序列比對。

1.4.6 膜孔蛋白和主動外排表型的檢測

取1mL對數生長期的細菌，用細菌總RNA快速抽提試劑盒標準抽提程序提取細菌RNA作為RT-PCR模板，提取完成后置-70℃備用。

反轉錄cDNA合成：采用M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒對提取的細菌RNA進行反轉錄，生成cDNA后置于-20℃備用。以cDNA稀釋10倍作為模板，分別以目的基因和內參基因（見表2）作為引物進行RT-PCR，銅綠假單胞菌ATCC27853作為正常對照，反應體系為10ul體系：SYBRGreen染料5ul，上下游引物各1ul，cDNA模板1ul，ddH202ul，反應條件如下：95℃ 420s，95℃ 30s,60℃15s，72℃15s，共40各循環。相對表達量以2-ΔΔCt法表示，ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內參基因）實驗株-（Ct目的基因-Ct內參基因）對照株。

表1 PCR引物序列

表2 熒光定量PCR引物序列

2 結果

2.1 抗菌藥物全敏的PA篩選及誘導

在本輪試驗中，共從臨床送檢標本中分離獲得20例抗菌藥物全敏的PA菌株，經頭孢他啶連續誘導傳代培養25代后，10株PA菌株誘導轉變為IRPA表型。見表3。

表3 誘導前后銅綠假單胞菌對監測藥物耐藥率的比較

2.2 產酶基因檢測結果

產 TEM的 IMP耐藥 PA（IRPA）有 7株，占 70%；產PDC的IRPA10株，占100%；產intIl的IRPA10株，占100%。見圖1-3。

圖1 TEM基因PCR電泳圖

圖2 PDC基因PCR電泳圖

圖3 IntI基因PCR電泳圖

TEM基因測序結果與GenBank上TEM同源性為 100%（登 錄 號：KX871187.1）。PDC基 因 測 序結果與GenBank上PDC同源性為100%（登錄號：KY066490.1）。Int-1基因測序結果與GenBank上Int-I同源性為99%（登錄號：KY171972.1）。

2.3 膜孔蛋白與主動外排表型檢測結果

OprD2的表達量降低的有8株，占80%，主動外排系統表型陽性IRPA3株，占30%。見表4。

表4 RT-PCR結果

3 討論

由于臨床治療PA感染的用藥局限性和不合理性，目前，IRPA己成為細菌耐藥相關研究的一個重要關注對象。三代頭孢菌素作為治療PA的經驗用藥，已在治療過程中出現耐藥，給臨床治療帶來困難。所以我們用三代頭孢菌素體外誘導臨床分離的抗菌藥物全敏PA產生亞胺培南耐藥，研究其耐藥的機制，從基因水平了解其耐藥的原因，為臨床合理使用抗菌藥物提供實驗室依據。

我們通過模擬體內抗菌藥物用量不足的環境，對PA臨床分離株進行體外亞抑菌濃度頭孢他啶連續誘導培養傳代，在設定的傳代次數結束時，有10株菌呈IPM耐藥表型，從一定程度上警示臨床，初始第三代頭孢菌素用量不足的短暫治療，可能誘發敏感的PA對其他抗生素也產生耐藥，從而導致患者住院時間延長、經濟負擔增重及病死率升高。

銅綠假單胞菌對碳青霉烯類的耐藥機制比較復雜，主要認為與以下幾點有關[9,10]：（1）產生碳青霉烯水解酶：包括超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）、頭孢菌素酶（AmpC酶）、金屬β-內酰胺酶（MBLs）等；（2）細菌細胞膜通透性的改變：細菌的外膜中與抗生素結合通道蛋白的表達量相對于正常來說表達減少或不表達，最終導致細菌表現為對該抗生素耐藥。其中OprD2被認為是亞胺培南進入銅綠的特異性通道[11]；（3）主動外排系統的過度表達：銅綠假單胞菌已知有12種抗藥小結節分裂區RND外排泵，其中 MexAB-OprM，MexCD-OprJ，MexEF-OprN，MexXY-OprM最具臨床意義[12]；（4）細菌生物膜的形成：由細菌自身，及其產生的外部多糖基質、蛋白質和核酸等共同包裹所組成[13]，其阻止和抑制白細胞、抗菌藥物等進入生物膜中,從而使細菌產生耐藥性；（5）整合子的介導：1989年Strokes等[14]在質粒、轉座子等可移動性遺傳結構上首次發現了整合子基因盒系統，它能整合多種藥耐藥基因并作為其主要載體使耐藥基因得到表達，從而使細菌發生多重耐藥，并可通過質粒、轉座子、染色體等可移動DNA元件上在同種菌或不同菌種之間進行水平傳播，使細菌的耐藥性得以廣泛擴散。

對經誘導耐藥試驗獲得的菌株進行基因檢測，試驗結果顯示，各誘導耐藥株的TEM陽性率有70%；PDC的陽性率有100%；intIl的陽性率有100%；OprD2的表達量降低的80%，主動外排系統表型陽率30%。說明經頭孢他啶誘導的PA產生IMP耐藥性涉及ESBLs，AmpC酶，整合子的存在，膜孔蛋白的缺失和主動外排系統激活等多種耐藥機制。IRPA不同產酶表型的陽性率差異可能與各報道的年份、地域差異及各地的抗菌藥物應用習慣有關。渠巍等[3]對比了貴陽地區和江蘇蘇南地區銅綠假單胞菌β-內酰胺酶類獲得性耐藥基因和膜孔蛋白OprD2的攜帶情況，貴陽地區以OprD2為主，而蘇南地區則是β-內酰胺酶和膜孔蛋白OprD2共同作用的結果。而有研究發現，北京地區基層醫院與三級醫院IRPA耐藥機制則是由外排泵系統和膜孔蛋白OprD2基因缺失共同介導的[15]。明德松等[16]薈萃分析了16個省市的耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌（CRPA）的耐藥基因分布，發現我國CRPA以OprD2基因缺陷為主，金屬酶基因VIM、IMP以及絲氨酸酶基因OXA表達異常為輔，主動外排系統基因也是一個重要因素。因此不排除由環境壓力不同引起區域間流行株的遺傳背景存在差異，誘導后結果隨之出現類似的區域現象。ESBLs長期以來都是引起PA產生多藥耐藥性的重要酶類，可水解三代頭孢及單環β-內酰胺類并被克拉維酸所抑制，引起PA對相應抗菌藥物產生耐藥。AmpC可水解三代頭孢及單環β-內酰胺類，能被四代頭孢、碳青霉烯類抑制，這可能也是本實驗中ESBLs和AmpC表型檢出率較高的原因之一。本實驗中誘導后的耐藥PA均攜帶整合酶I，說明這種耐藥性可以在細菌間傳播，導致細菌迅速發展成多重耐藥。

PA對第三、四代頭抱菌素耐藥的機制主要是產生高活性頭孢菌素酶以及外排系統過度表達，而外膜蛋白OprD2表達的缺失或減少是導致銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥的重要機制，本實驗中誘導后的耐藥株表現出膜孔蛋白的表達降低和外排泵的過度表達，說明兩種機制一起作用導致PA對亞胺培南的耐藥性。

本研究探討了頭孢他啶誘導全敏PA臨床分離株發生耐藥的可能機制，研究發現ESBLs，AmpC酶，整合子，膜孔蛋白的缺失和主動外排系統激活等多種耐藥機制均存在，故頭孢他啶可通過使PA產生各種耐藥機制從而對其他藥物也出現耐藥。臨床需警惕抗菌藥物劑量不足或偏好用藥導致全敏菌株出現耐藥現象的發生。后期我們將繼續對誘導所得IRPA菌株進行深入研究，著重研究誘導前后基因表達量的變化及其調控基因的變化。從分子耐藥機制等方面進行研究，為指導臨床合理用藥提供參考依據。