二甲雙胍對Eca-109食管癌細胞遷移能力的影響及機制研究*

于敬坤，韓學超，李明志，隨振陽，張 琪，王長友

1.華北理工大學附屬醫院普外科(唐山 063000);2 華北理工大學醫學實驗研究中心 (唐山 063000)

我國是腫瘤大國，惡性腫瘤發生率、病死率均高于世界平均水平，有研究指出我國腫瘤發病率正以每年3%～5% 的速度增加，病死率也由20 世紀70 年代以來一直呈上升趨勢[1-4]。食管癌是我國常見十大惡性腫瘤之一，具有高發病率、高病死率等特點。Kobayashi等[5]的體外研究表明，二甲雙胍可通過下調食管癌細胞周期的相關蛋白，抑制其生長、增殖。本實驗通過檢測Eca-109食管癌細胞在鹽酸二甲雙胍的作用下，其增殖能力、遷移能力的變化，觀察遷移相關蛋白的改變，探索二甲雙胍影響Eca-109食管癌細胞遷移能力的機制。

材料與方法

1 材 料 惡性腫瘤細胞株：Eca-109食管癌細胞獲贈于華北理工大學醫學實驗研究中心。主要試劑及儀器：DMEM完全培養基[賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司]；胎牛血清(浙江天杭生物公司)；青鏈霉素混合液、胰蛋白酶(美國Gibco分司)；鹽酸二甲雙胍(北京索萊寶科技有限公司)；MTT試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)；96孔板、6孔板(德國Eppendorfna分司)；酶標儀、顯影儀、電泳轉膜相關器材(上海Bio-Rad公司)；MMP-14、GLUT1抗體(臺灣Arigo公司)；MMP-2、MMP-9抗體(美國Cell Signaling公司)；β-Actin抗體[天徳悅(北京)生物科技有限責任公司]；HRP標記山羊抗小鼠/兔IgG(H+L)(上海碧云天生物技術研究所)等。

2 方 法 ①細胞培養：Eca-109食管癌細胞是用細胞培養液(含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM完全培養基)培養，并置于37℃恒溫、95%O2、5%CO2空氣孵箱中(相對濕度95%)。依據細胞密度按1∶2或1∶3比例傳代(傳代時間約為2～3 d)，Eca-109食管癌細胞呈貼壁生長，待形成致密單層細胞，利用胰蛋白酶消化并形成均勻單一的游離細胞后，取生長狀態良好的對數生長期細胞進行實驗。② MTT實驗檢測細胞增殖情況：將Eca-109食管癌細胞均勻地播種于96孔板中(每個培養孔內約有104個細胞)，待細胞完全貼壁后，給予含有不同濃度鹽酸二甲雙胍(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/ml)的細胞培養液培養。24 h后，移除培養液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)或生理鹽水沖洗細胞兩次(避免藥物與MTT試劑反應而未形成結晶或未完全形成結晶)。在每孔中加入了100 μl的不含藥物的單純細胞培養液及10 μl濃度為5 mg /ml的MTT試劑(MTT溶于PBS液或生理鹽水中)。將96孔板置于恒溫箱中孵化4 h以上，待紫藍色結晶完全形成，小心移除DMEM完全培養基(盡量避免吸走結晶)，然后每個孔內都注入100 μl的二甲基亞砜溶液(DMSO)，并置于搖床上中速搖勻10 min。結晶完全溶解后，使用酶標儀測各孔在490 nm波長處的吸光值(OD值，OD值可反映各孔相對細胞數量，間接反映細胞增殖能力)。重復實驗3次，SPSS Statistic 17.0軟件評估所測數據。根據藥物劑量依賴性實驗,1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍對Eca-109食管癌細胞在作用24、48、72 h時均具有抑制作用，且在有效抑制范圍內，未達抑制峰值，作為實驗藥物濃度，便于調控(鹽酸二甲雙胍分子量約為165,1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍≈10 μmol/ml鹽酸二甲雙胍，二甲雙胍主要在小腸內被人體吸收，口服二甲雙胍后2 h即可達藥物濃度峰值2 μg/ml，藥物易積聚于腸壁，為血漿濃度的10～100倍，體外實驗藥物濃度需控制在體內用藥的20倍以內，考慮含服鹽酸二甲雙胍可使食管癌細胞周圍藥物濃度增加)，因此可采用1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍作為后續實驗的藥物濃度)。另取一潔凈的96孔板，檢測1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍作用于Eca-109食管癌細胞24、48、72 h時的細胞增殖能力(MTT操作步驟同上)。③劃痕實驗觀察細胞遷移能力：預先用潔凈的記號筆在6孔板背面劃橫線，盡可能均勻、平直，約隔0.5～1.0 cm一道，橫穿每孔底部，每孔至少有3條線穿過。將Eca-109食管癌細胞均勻地播種在預處理的6孔板中培養。待細胞密度達70%～80%時，用200 μl無菌槍頭盡量垂直于6孔板底部的橫線做劃痕，PBS液或生理鹽水洗去劃下的細胞，在倒置顯微鏡下取筆直一段做觀察并攝影，給予含有1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍的細胞培養液(設置為MET組)及單純細胞培養液(設置為CK組)于37℃恒溫、95%O2、5%CO2空氣孵箱中培養，作用24、48 h時觀察細胞于劃痕處的細胞遷移、生長情況，用Image J及SPSS Statistic 17.0處理圖像、數據，分析兩組無細胞區域的面積占比及其平均值并判斷其差異是否有統計學差異。用細胞遷移指數(Migration index，MI)表示細胞遷移的快慢。MI=100%(S0-St)/S0,St是指劃痕后t h后測得的無細胞區域面積占比，S0是指劃痕后即可測得的無細胞區域面積占比,St-S0是指t h到劃痕初這段時間內無細胞區域占比變化值。④Western blotting觀察鹽酸二甲雙胍對Eca-109食管癌細胞遷移相關蛋白MMP-2、MMP-9、MMP-14、Glut1表達活性的影響：用含1.50 mg/ml的鹽酸二甲雙胍與單純細胞培養液分別培養Eca-109食管癌細胞，48 h后用組織、細胞裂解液裂解細胞并提取細胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后于100℃下變性5 min。依次制備8%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉法轉膜將蛋白轉到硝酸纖維素膜(PVDF膜)上，常溫下用封閉液(5%脫脂奶粉、0.02 mmol/L Tris-HCL、0.5 mmol/L NaCl、0.1%吐溫20、pH 7.5)封閉2 h以上，TBST(0.02 mmol/L Tris-HCL、0.5 mmol/L NaCl、0.1%吐溫20、pH 7.5)洗膜3次后，加入一抗并在4℃冰箱內過夜，次日TBST洗膜3次后加入二抗常溫孵化2 h以上，TBST洗凈二抗，加入顯影劑在顯影儀內顯影，以β-Actin為內參蛋白，在內參平齊的前提下，觀察并用Image J及SPSS Statistic 17.0處理蛋白條影、分析數據，評估MET、CK兩組細胞遷移相關蛋白的表達水平。

結 果

1 鹽酸二甲雙胍對體外Eca-109食管癌細胞增殖能力的影響 含不同濃度鹽酸二甲雙胍的細胞培養液培養Eca-109食管癌細胞48 h后，隨著藥物濃度的增高，96孔板各孔的OD值逐漸降低(圖1)。

圖1 不同濃度鹽酸二甲雙胍作用于體外

用含1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍的細胞培養液(MET組)與不含鹽酸二甲雙胍的細胞培養液(CK組)培養Eca-109食管癌細胞24、48、72 h，MET組的OD值均小于CK組(圖2)，見表1；相對增殖能力也隨鹽酸二甲雙胍作用時間的延長而遞減(細胞相對增殖能力=100%×某時刻實驗組細胞增殖能力/同時刻對照組細胞增殖能力)(圖2)。

2 1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍對體外Eca-109食管癌細胞遷移能力的影響 劃痕后24 h，MET組無細胞區域面積占比明顯高于CK組；而劃痕后0、48 h，MET組及CK組無細胞區域面積占比無統計學差異(圖3)，見表2；細胞遷移指數(MI)也表現為劃痕后24 h，MET組小于CK組，48 h時兩組無統計學差異，細胞遷移指數(MI)均為1，表現為48 h時兩組細胞劃痕處均已愈合(圖3)，見表3。

3 1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍對體外Eca-109食管癌細胞遷移能力相關蛋白MMP-2、MMP-9及GLUT1、MMP-14的影響 含1.5 mg/ml鹽酸二甲雙胍的細胞培養液體外培養Eca-109食管癌細胞48 h后，MET組遷移相關蛋白MMP-2、MMP-9的表達量分別是(0.4026±0.2224)、(0.5009±0.2728),均明顯少于CK組的(1.0309±0.0687)、(1.0167±0.0905),差異具有統計學意義(P<0.05)(圖4)；蛋白GLUT1、MMP-14的表達量也表現為CK組的(1.1991±0.2134)、(1.0025±0.1179)高于MET組的(0.7751±0.3114)、(0.6495±0.2563),差異具有統計學意義(P<0.05)(圖5)。

表1 1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍對體外Eca-109食管癌細胞增殖能力的影響

圖2 1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍對Eca-109食管癌細胞增殖能力及相對增殖能力的影響

圖3 1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍對體外Eca-109食管癌細胞遷移能力的影響(40×)

表2 劃痕后0、24、48 h的無細胞區域面積占比(%Area)

表3 劃痕后24、48 h的細胞遷移指數(MI)

討 論

我國是食管癌高發地區，其發病率及死亡率均居世界首位，有研究指出，我國2011年新增食管癌患者近30萬例，死亡人數約22萬例，占據世界一半以上，我國食管癌發病率及病死率約占世界的64.7%及54.7%，2012年較2011年比例有所下降，其發病率、病死率約為50%、49%，但我國人口基數大,每年仍有很多患者承受食管癌病痛的折磨[6]。

注：MET組Eca-109食管癌細胞的MMP-2、MMP-9的表達量與CK組比較，#P<0.05

注：MET組Eca-109食管癌細胞的GLUT1、MMP-14的表達量與CK組比較，#P<0.05

二甲雙胍(Metformin,MET)是重要的臨床降血糖藥物，具有良好的短期、長期降糖效果[7-10]。有研究表明，二甲雙胍可使中國新診斷的2型糖尿病患者的 HbA1c水平降低1.8%(可能含安慰劑效應),并且不受體重的影響[11]。英國的一項病例對照研究資料表明，二甲雙胍的使用與惡性腫瘤發生風險的下降具有一定相關性，二甲雙胍使用時間的延長及使用次數的增加，可使惡性腫瘤的發病風險降低[12-13]，這可能通過促進細胞內脂類物質代謝、調節機體內分泌水平、抑制血小板亢進及降低血液高凝狀態等途徑，抑制腫瘤細胞的發生、發展[14]。通過該實驗可明顯發現，隨著鹽酸二甲雙胍藥物濃度的增高，Eca-109食管癌細胞的增殖能力表現為遞減趨勢；當給予含1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍的細胞培養基體外培養Eca-109食管癌細胞24、48、72 h時，其增殖能力均弱于對照組，并具有統計學差異；相對增殖能力也隨時間的遞增而遞減，表明MET組Eca-109食管癌細胞增殖能力受抑制程度具有時間相關性。MTT實驗結果說明鹽酸二甲雙胍可抑制Eca-109食管癌細胞的生長、增殖，降低Eca-109食管癌細胞的增殖能力，并表現為劑量及時間依賴性。

惡性腫瘤細胞具有高增殖能力、高遷移能力、分化程度低等特點，也是區別于正常細胞的重要特性。食管癌患者早期一般無特殊癥狀，當出現進行性吞咽困難、飲水嗆咳、痰中帶血或咯血等臨床癥狀時，很大比例的患者已發生腫瘤細胞轉移，可侵犯臨近組織及器官，當食管癌侵犯氣管時會引起患者長期刺激性咳嗽，侵犯聲帶時引起患者聲嘶等。有臨床研究表明，在糖尿病人群中，長期服用二甲雙胍的患者，其惡性腫瘤發生率及轉移率要低于非二甲雙胍治療人群，注射胰島素治療的患者，其腫瘤發生風險、轉移率要高于非胰島素治療人群[15-16]。劃痕實驗是檢驗細胞遷移能力的重要實驗之一，在實驗中，MET組與CK組對比，劃痕后24 h，MET組無細胞區域面積占比明顯高于CK組，細胞遷移指數(MI)明顯低于CK組，表明鹽酸二甲雙胍可抑制Eca-109食管癌細胞的遷移能力；遷移后48 h，兩組的無細胞區域面積占比及細胞遷移指數(MI)均統計學差異，但CK組于劃痕后24 h的無細胞區域面積占比低于MET組，不除外劃痕24 h后CK組的遷移速度高于MET組；結合鏡下觀察及統計學分析結果，鹽酸二甲雙胍可抑制Eca-109食管癌細胞的遷移能力。

基質金屬蛋白酶系(MMPs)是鋅依賴性蛋白水解酶家族[17]，在正常組織細胞中，MMPs表達量極少。MMPs可以降解細胞外基質，引發細胞從組織中脫落，在腫瘤細胞中，MMPs的高表達，易使腫瘤細胞脫落，從而發生腫瘤轉移；MMPs中的明膠酶 MMP-2、MMP-9在腫瘤細胞中表達量一般遠高于正常細胞，這與腫瘤的浸潤、轉移有密切關系[18-20]。由Western blotting結果可見，經鹽酸二甲雙胍處理后的Eca-109食管癌細胞的MMP-2、MMP-9的表達量均少于CK組，聯系劃痕實驗結果，提示鹽酸二甲雙胍可能通過降低MMP-2,、MMP-9的表達量抑制Eca-109食管癌細胞的遷移能力。MMP-14(膜型基質金屬蛋白酶-1，MT1-MMP)同樣具有消化細胞外基質作用，與此之外，MMP-14還參與多種細胞組織的病理生理過程，是最典型的膜型基質金屬蛋白酶(MT1-MMP)[21],MMP-14主要存在于細胞膜上，可以激活部分明膠酶(如MMP-2、MMP-9)。人源葡萄糖轉運蛋白1(GLUT1)主要促進葡萄糖以擴散形式進入紅細胞，也有轉運葡萄糖入腦及其他組織供能等作用，有研究指出GLUT1會在惡性腫瘤細胞中呈高表達狀態，可能是誘發腫瘤轉移的中介物質，GLUT1與MMP-14關系密切，可激活MMP-14使其發揮生理功能[22]。鹽酸二甲雙胍處理后的Eca-109食管癌細胞的GLUT1、MMP-14表達量相對于CK組明顯下降，提示鹽酸二甲雙胍降低Eca-109食管癌細胞遷移能力可能與抑制Eca-109食管癌細胞內的GLUT1、MMP-14表達量有關。

綜上所述，鹽酸二甲雙胍可抑制體外Eca-109食管癌細胞的生長、增殖；并且可能通過抑制GLUT-1、MMP-14、MMP-2、MMP-9信號通路抑制體外Eca-109食管癌細胞的遷移能力。