丙泊酚抑制缺氧/復(fù)氧HUVECs細(xì)胞中miR-15b表達(dá)及細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究*

霍彥龍,郝璞珩,田 道

1.延安大學(xué)附屬醫(yī)院(延安716000);2.陜西省吳起縣人民醫(yī)院麻醉科(吳起717600);3.西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科(西安710077);4. 陜西省榮譽(yù)軍人康復(fù)醫(yī)院麻醉科(渭南714200)

丙泊酚(Propofol)是目前臨床中應(yīng)用廣泛的靜脈麻醉劑，具有起效迅速、蘇醒率高、副作用少等特點(diǎn)，因其化學(xué)結(jié)構(gòu)本質(zhì)類似于抗氧化物，故在應(yīng)用過程中能夠發(fā)揮相關(guān)作用[1-2]，有益于減輕圍手術(shù)期缺血再灌注損傷(Ischemia/Reperfusion,I/R)。有研究表明[3]，丙泊酚能夠?qū)Υ笫髧中g(shù)期過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用，從而減輕心肌I/R損傷。微小RNA(miRNA)作為一種非編碼短鏈RNA，通過對其靶基因的調(diào)控，在包括神經(jīng)病理性疼痛在內(nèi)的諸多生理過程中發(fā)揮相關(guān)作用[4-6]，其在I/R發(fā)展過程中對于心、腎臟器損害的中作用已得到了初步認(rèn)同[7]。有研究表明[8]，丙泊酚干預(yù)下的缺氧狀態(tài)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在差異性表達(dá)的miRNA，能夠參細(xì)胞自噬生理過程的調(diào)節(jié)，這其中就包括miR-15b。miR-15b與抗凋亡蛋白bcl-2間的靶向關(guān)系已明確[9]，丙泊酚是否能夠通過該途徑發(fā)揮其組織、細(xì)胞保護(hù)作用，值得探究。I/R動物模型具有不穩(wěn)定性，易受到體內(nèi)多方面因素的影響，故而在體外不能確切地反映出藥物對組織、細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制；而體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)方法簡便、可控性較好[10]，故本研究擬建立缺氧/復(fù)氧細(xì)胞模型，對丙泊酚與miR-15b之間的相互作用機(jī)制進(jìn)行探討。

材料和方法

1 主要試劑、儀器 DMEM培養(yǎng)基、小牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Gibco公司，美國，生產(chǎn)批號:31600034、1600-044)；FITC-兔抗人bcl-2單抗、兔抗人β-actin多抗、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(Abcam公司，英國，生產(chǎn)批號：ab32124、ab8227、ab20272)；RNAisoTMPlus試劑盒(TaKaRa公司，日本，生產(chǎn)批號：D9108A)；細(xì)胞裂解液(索萊寶科技有限公司，中國，生產(chǎn)批號：R0020)，BCA蛋白定量試劑盒(索萊寶科技有限公司，中國，生產(chǎn)批號：PC0020)。Western-blot配膠試劑盒(泛思科技有限公司，中國，生產(chǎn)批號：FS201)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)試劑盒(TaKaRa公司，日本，生產(chǎn)批號：DRR047S、DRR096A)；丙泊酚注射液(西安力邦制藥有限公司，中國，生產(chǎn)批號：H19990282)；膜聯(lián)素Ⅴ/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(翊圣生物公司，中國，生產(chǎn)批號：40302ES20)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)；流式細(xì)胞儀(BD公司，美國)；凝膠電泳儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀(Bio-Rad公司，美國)。

2 細(xì)胞培養(yǎng) 將購置的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)(ATCC細(xì)胞庫，中國分公司)消化后，調(diào)整密度，接種于含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液中，在5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，初次接種后12 h換液，以后每24 h換液一次。2～3次傳代后待細(xì)胞密度生長融合至80%～90%左右時(shí)，構(gòu)建體外I/R細(xì)胞模型，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；共分為三組，對照組：棄去各組細(xì)胞完全培養(yǎng)液，加入無血清、無糖培養(yǎng)液，置入培養(yǎng)箱中，以5% CO2、5% N2、37℃條件下培養(yǎng)24 h，隨后換完全培養(yǎng)液，恢復(fù)正常有氧培養(yǎng)條件，培養(yǎng)6 h；實(shí)驗(yàn)組：缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)條件與對照組相同，復(fù)氧后完全培養(yǎng)液中加入丙泊酚(150 μmol/L)，培養(yǎng)6 h；空白組細(xì)胞正常有氧條件培養(yǎng)。

3 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR) 按RNAisoTMPlus試劑盒說明書，提取各組細(xì)胞中總RNA；檢測RNA質(zhì)量。根據(jù)PrimerBank公布的基因序列，設(shè)計(jì)miR-15b、bcl-2及內(nèi)參U6的引物序列(見表1)；按試劑盒說明，反轉(zhuǎn)錄合成miR-15b、bcl-2 cDNA；根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒說明配制反應(yīng)體系后加樣，以U6為內(nèi)參，進(jìn)行PCR反應(yīng)，具體反應(yīng)條件(見表1)。12%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，應(yīng)用凝膠圖象成像系統(tǒng)(Alpha Innotech公司)檢測PCR產(chǎn)物質(zhì)量。每個(gè)樣本設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，每批樣本設(shè)置1孔空白對照。目的基因miR-10b、bcl-2的相對表達(dá)量采用公式2-△△Ct(△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參照Ct 值，△△Ct=實(shí)驗(yàn)組△Ct-對照組△Ct)進(jìn)行計(jì)算。

表1 引物序列及PCR反應(yīng)條件

4 Western-blot 提取各組細(xì)胞中蛋白,按照BCA蛋白定量試劑盒說明書檢測蛋白質(zhì)含量；取50 μg蛋白進(jìn)行電泳，電泳完成后切取目的蛋白bcl-2、β-actin所在膠片；轉(zhuǎn)膜、染色、封閉后加兔抗人bcl-2抗體(1∶2500)、兔抗人β-actin抗體(1∶3000)孵育2 h；PBS漂洗后，加HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體(1∶5000)，室溫下孵育2 h；再次洗膜，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。顯影、定影后，對X線片掃描成像，目的蛋白的表達(dá)量以bcl-2/β-actin比值表示。

5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 將各組細(xì)胞消化，吹懸，用2.5 ml的磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer saline, PBS)洗滌2次，離心5 min(1000 r/min)；最后一次洗滌離心后，用1 ml PBS液輕柔吹懸細(xì)胞，呈單細(xì)胞懸液狀態(tài)，隨即加入2 ml無水乙醇固定，棄去上清，PBS液再次洗滌后，標(biāo)記、待檢。每個(gè)待檢樣本中均分別加10 μl Annexin V-FITC以及5 μl PI，混勻后避光條件下，于室溫下反應(yīng)15 min；隨后用300目濾膜濾去細(xì)胞團(tuán)塊，上流式細(xì)胞儀檢測。使用Expo32 ADC Analysis系統(tǒng)對細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果進(jìn)行分析。

結(jié) 果

1 RT-qPCR檢測結(jié)果 RT-qPCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組miR-15b的表達(dá)水平低于對照組，實(shí)驗(yàn)組HUVECs細(xì)胞中bcl-2在mRNA的表達(dá)水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

圖1 miR-15b及 bcl-2 mRNA的表達(dá)水平

2 Western-blot檢測結(jié)果 Western-blot結(jié)果顯示，經(jīng)缺氧/復(fù)氧處理后，實(shí)驗(yàn)組和對照組HUVECs細(xì)胞中bcl-2表達(dá)均低于正常培養(yǎng)狀態(tài)下的HUVECs細(xì)胞(空白組)，但實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中bcl-2在蛋白水平的表達(dá)高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖2 bcl-2蛋白的表達(dá)水平

3 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)檢測實(shí)驗(yàn)組、對照組、空白組中HUVECs細(xì)胞凋亡率。與對照組相比，空白組、實(shí)驗(yàn)組HUVECs細(xì)胞凋亡率降低(細(xì)胞凋亡率=B2+B4，即早期凋亡率+晚期凋亡率)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖3)。

圖3 各組HUVECs細(xì)胞凋亡率

討 論

分布于人體循環(huán)組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管內(nèi)外組織間的屏障，參與正常生理與諸多疾病過程[11]。缺血再灌注損傷細(xì)胞模型的構(gòu)建，涉及通過活性氧(Reactive oxygen apecies，ROS)導(dǎo)致的氧化應(yīng)激所誘發(fā)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。作為有效的氧化還原劑，ROS通過脂質(zhì)過氧化以及對還原酶的抑制作用直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞；此外，ROS還通過上調(diào)細(xì)胞粘附分子的表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，并刺激中性粒細(xì)胞的活化和趨化性，從而誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加。

丙泊酚在結(jié)構(gòu)上類似于內(nèi)源性抗氧化維生素E，并具有抗氧化活性，通過對抗氧化應(yīng)激保護(hù)細(xì)胞免受損傷[1]。本研究中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組HUVECs在丙泊酚(150 μmol/L)干預(yù)下培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞凋亡率下降；實(shí)驗(yàn)組HUVECs細(xì)胞中bcl-2在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均高于對照組(P<0.05)。以上結(jié)果，進(jìn)一步驗(yàn)證了丙泊酚對I/R的保護(hù)作用。一方面，丙泊酚干預(yù)狀態(tài)下，能夠通過激活與細(xì)胞存活直接相關(guān)的AKt信號通路以及抗凋亡蛋白bcl-2，抑制細(xì)胞凋亡過程[1]。另一方面，丙泊酚干預(yù)能夠一定程度抑制自噬效應(yīng)蛋白beclin-1的表達(dá)，并加強(qiáng)其與抗凋亡蛋白bcl-2的相互作用，減少過度自噬，降低細(xì)胞凋亡[12]。

上述途徑中涉及的細(xì)胞自噬相關(guān)基因及凋亡相關(guān)蛋白均可由miRNA參與調(diào)節(jié)[13-14]，過度自噬能夠引發(fā)細(xì)胞損傷、凋亡增加，丙泊酚干預(yù)下的缺氧狀態(tài)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在差異性表達(dá)的miRNA，如miR-15b等[6]，能夠參細(xì)胞自噬生理過程的調(diào)節(jié)。miR-15b能夠影響多種細(xì)胞的增殖、凋亡能力[15]，其能夠負(fù)性調(diào)控bcl-2；本研究中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組miR-15b的表達(dá)水平低于對照組，而bcl-2的表達(dá)高于對照組(P<0.05)，進(jìn)一步印證了兩者間的靶向關(guān)系。bcl-2能夠與bax形成家族性二聚體，通過所形成二聚體(bcl-2/bax)的結(jié)構(gòu)性比例變化參與調(diào)解細(xì)胞凋亡過程，其中bcl-2主要發(fā)揮抗凋亡作用[16]。因此，丙泊酚可能通過I/R細(xì)胞模型中miR-15b的介導(dǎo)，影響其靶基因bcl-2的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，但涉及三方的具體參與機(jī)制仍需后續(xù)深入。

綜上，丙泊酚能夠抑制人缺血再灌注損傷細(xì)胞模型中miR-15b的表達(dá)，并影響其靶基因抗凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)，從而降低細(xì)胞凋亡率。為臨床工作中圍手術(shù)期麻醉藥物的合理應(yīng)用和選擇提供了一定理論依據(jù)，并為缺氧缺血性麻醉并發(fā)癥的防治提供了可能的分子靶標(biāo)。