外源性Apelin-13對重癥急性胰腺炎大鼠治療作用及其機制研究*

徐 博，蘇軍濤，鐘 燁，崔明新，王長友，陳建立，王曉濤，田 煒，張國志△

1.華北理工大學附屬醫院普外科(唐山 063000);2.華北理工大學醫學實驗中心(唐山 063000)

重癥急性胰腺炎(SAP)是一種由多種原因導致的炎癥因子釋放，致層級樣改變引起的高發病率、高病死率的常見急腹癥，SAP 病情迅猛，早期即可引發全身炎癥反應綜合征(SIRS)，SIRS多較難控制，從而進展為多臟器功能障礙綜合征(MODS)[1-2]。Apelin是Tatemoto等1998年發現的一種血管活性肽，逆轉錄過程中可被蛋白水解酶分解為多個蛋白活性片段，其中Apelin-13是目前已知Apelin家族存在范圍最廣活性最強的片段[3]。Apelin-13被發現廣泛存在于大腦、下丘腦、胃腸、心臟及血管中，且參與循環、消化、呼吸、神經內分泌等多種生物學功能[4]。但Apelin-13對于SAP的療效及機制尚不明確。本實驗通過外源性Apelin-13治療SAP大鼠，觀察外源性Apelin-13對SAP大鼠的療效并探討NO在其中作用機制。以求為外源性Apelin-13治療SAP的臨床應用提供理論支持。

材料與方法

1 材 料 ①實驗動物及分組：取11～13周齡健康雄性Sprague Dawley大鼠60只(SPF級)，體重225～255 g，由華北理工大學動物實驗中心提供。依據隨機數表法隨機分三組，分別為空白組、SAP組、治療組，各20只。空白組：按照SAP組標準進行開腹，分離胃十二指腸，找到胰膽管，注射等量生理鹽水。SAP組：按照SAP模型制備方式造模，給予等量生理鹽水處理。治療組：外源性Apelin-13治療組大鼠，按照SAP組標準制備SAP大鼠，于造模后立即給予外源性Apelin-13 0.1 mg/kg大鼠陰莖背靜脈注射。②試劑：牛黃膽酸鈉、水合氯醛購于上海吉利生化公司，內參β-actin抗體等Western blot相關試劑均購自北京瑣來寶生物技術有限公司，Apelin-13購自Santa Cruz，AMS、NO、IL-6、TNF-αELISA試劑盒購分別購于自北京科達生物技術股份有限公司及R&D Systems，iNOS抗體、eNOS抗體購于上海酶奧森生物科技有限公司。

2 SAP動物模型建立 大鼠SAP模型制備：本實驗動物模型的制作參考白檳等[5]的SAP模型，并進行部分改進，即造模前8 h給予SD大鼠禁食、造模前4 h禁水,術前準備完畢后用1 ml注射器抽取約0.75 ml 10%的水合氯醛腹腔注射麻醉(麻醉劑量依據0.3 ml/100g)。確認麻醉后,牽引大鼠四肢固定在操作臺上,常規備皮、消毒、鋪單，于大鼠劍突下約1橫指處沿腹白線向下做一長約4～5 cm縱行切口，逐層打開大鼠腹腔，可見一中空透明的斜行管道起自十二指腸大乳頭處，長約2～3 cm，此斜行管道即為大鼠膽總管。30 mm動脈夾將肝門部膽總管夾閉，以防5%牛黃膽酸鈉溶液逆行進入肝臟及膽囊，助手以血管鉗提起大鼠十二指腸，實驗者在十二指腸大乳頭孔處緩慢置入一次性靜脈留置針(針頭型號為25G)，穿刺進胰膽管，進針長度約10 mm(注意動作輕柔切勿損傷胰膽管)，拔出靜脈留置針針芯，采用1 ml注射器緩慢勻速推注5%的?；悄懰徕c溶液,肉眼可見胰腺組織均勻隆起，顏色及質地較造模前無明顯改變，緩慢退出一次性靜脈留置針，還納大鼠胃十二指腸等組織回腹腔，逐層單純間斷縫合關腹，大鼠SAP模型制備完畢。注意實驗過程中無菌操作及避免副損傷。

3 標本采集 各組SD大鼠均取3、6、12、24、48 h，各組5個時間點隨機取出4只同法麻醉后，于原腹部切口向下做縱行延長切口開腹至顯露下腔靜脈位置。用一次性靜脈采血針取下腔靜脈血約4 ml，并分離取出胰腺組織。

4 生物化學指標測定 淀粉酶(AMS)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、一氧化氮(NO)等指標按照ELISA試劑盒說明書進行。

5 胰腺組織病理學檢測 于-80 ℃冰箱取部分胰腺組織，置于-20 ℃冰箱4 h，福爾馬林溶液固定6 h，水洗6 h，石蠟包埋、切片、脫蠟、HE染色、封片、電子顯微鏡閱片。

6 蛋白質表達檢測 標準Western blot過程檢測誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、內皮型一氧化氮合酶(eNOS) 蛋白表達情況。

結 果

1 各組大鼠組織病理學改變 肉眼下觀察,各組胰腺大體改變：空白組大鼠胰腺隨時間延長色澤及質地較造模前未出現明顯變化，未見明顯水腫、出血及壞死，胰腺組織與周圍分界清晰。SAP組大鼠注射5%牛黃膽酸鈉后，胰腺組織充血、水腫隨時間改變不斷加重，自12 h開始腹部出現大量血性腹水，周圍各段腸管可見腫脹，伴刺鼻惡臭味，胰腺組織出現肉眼可見的出血及部分壞死，至24 h胰腺組織遍布壞死灶、胰腺邊緣無法辨識。Apelin-13治療組大鼠胰腺隨時間變化光澤變暗,可見少量充血，至12 h可見隨時間進展胰腺組織逐漸出現點狀壞死灶，胰腺狀態明顯好于SAP組。HE染色200倍鏡下觀察，各組胰腺病理改變(圖1)：空白組隨時間變化胰腺病理切片未見顯著病理學改變，各時間點胰腺小葉未見明顯水腫及炎癥細胞浸潤、胰腺腺泡輪廓清晰可見。SAP組隨時間進展胰腺間質及血管可見多量炎細胞，大片狀出血、壞死灶明顯，胰腺小葉大量炎細胞聚集，胰腺組織可見明顯纖維性滲出，胰腺腺泡結構呈空泡樣甚至消失。治療組隨時間延長胰腺小葉結構較完整，胰腺間質血管可見少量白細胞浸潤，至12 h小部分腺泡結構消失，間質出現較多量炎癥細胞浸潤滲出，可減少量出血點及壞死灶。

圖1 各組胰腺組織炎癥嚴重程度對比圖(HE染色，×200)

2 大鼠血清生化檢驗結果 大鼠血清生化檢驗結果見表1～4。ELISA結果提示：空白組大鼠造模后AMS、IL-6、TNF-α、NO等指標隨時間延長無明顯改變(P<0.05)。SAP組大鼠造模后AMS、IL-6、TNF-α、NO等指標明顯高于空白組及治療組(P<0.05)，且隨時間變化仍逐漸增高。治療組大鼠AMS、IL-6、TNF-α、NO隨時間變化有逐漸增高趨勢，且相同時間內治療組各指標均高于空白組(P<0.05)，而低于SAP組(P<0.05)?？梢钥闯鲈谥委熃M3 h NO濃度較SAP組并無明顯改變，在此之后的時間內NO濃度水平增高，但和SAP組差距逐漸拉大，即治療組NO濃度處于增高趨勢，但遠低于SAP組(P<0.05)。

表1 各組大鼠血清淀粉酶含量(U/L)

注：與SAP組相比，*P<0.05

表2 各組大鼠血清NO含量(μmol/L)

注：與SAP組相比，*P<0.05

表3 各組大鼠血清 IL-6含量(ng/ml)

注：與SAP組相比，*P<0.05

3 各組大鼠胰腺組織iNOS、eNOS表達情況 利用Western blot檢測了各組大鼠iNOS、eNOS在處理后48 h的表達改變情況(圖2～3)。iNOS的相對表達量在SAP組(0.884±0.154)和治療組(0.215±0.057)中均高于空白對照組(0.101±0.053)，但治療組中，iNOS的相對表達量較于SAP組明顯受到抑制。eNOS的相對表達量在SAP組(0.153±0.044)和治療組(0.386±0.071)均低于空白對照組(0.878±0.166)，但治療組中，iNOS表達相較于SAP組明顯受到抑制。

表4 各組大鼠血清TNF-α含量(ng/ml)

注：與SAP組相比，*P<0.05

圖2 各組iNOS蛋白相對表達量

圖3 各組 eNOS蛋白相對表達量

討 論

研究SAP時發現，體內眾多細胞因子和炎癥介質呈現級聯反應的特征，從而引起更為致命的SIRS和MODS是SAP最嚴重最常見的死因。在MODS疾病演變過程中，TNF-α、IL-6及NO等炎癥因子扮演著舉足輕重的角色。淀粉酶水平是臨床最常用于診斷急性胰腺炎的生化指標，TNF-α、IL-6及NO水平是SAP的重要診斷指標和預后評價指標[6]，炎癥介質水平與SAP損傷程度及預后聯系緊密。

HE染色結果顯示：空白組隨時間變化未見明顯病理學改變，SAP組、治療組隨造模時間延長，炎癥損傷均呈逐漸加重趨勢，但是SAP組大鼠相同時間內胰腺組織損傷程度遠遠重于治療組。證明外源性Apelin-13對SAP治療有效。

TNF-α與多種炎癥反應的發生發展密切相關，且處于炎癥反應的起始部位，多項數據表明SAP損傷程度及預后與TNF-α的濃度高低正相關[7]。TNF-α由體內被激活后的單核巨噬細胞產生，高濃度的活化TNF-α可啟動“瀑布樣”炎癥反應，刺激炎癥細胞產生多種組織損傷因子，引起胰腺出血、壞死，受損傷的胰腺組織反復刺激體內單核巨噬細胞，進一步產生更多的炎癥因子，嚴重的炎癥反應可帶來內質網應激損傷，同時可作用于血管內皮細胞引起感染性休克等[8]。本實驗通過TNF-α水平證實SAP模型制備成功，外源性Apelin-13對SAP治療有效。

IL-6是一種在全身炎癥反應中處于核心地位的細胞因子，SAP時IL-6顯著增高，異常增高的IL-6刺激人體產生大量抗體及CRP引起細胞毒性作用，高濃度IL-6還可與TNF-α產生協同作用產生起微循環血栓損傷機體[9]，從而引起全身多器官損傷反應。因而IL-6增高水平與SAP嚴重程度密切相關[10]，IL-6成為人們研究SAP疾病發生發展的重要標志物。本實驗通過IL-6水平再次證實SAP模型制備成功，外源性Apelin-13對SAP治療有一定效果。

NO是血管內皮細胞被激活后產生的一種調節血管活性的信號分子。人體內NO合成有NOS催化和非NOS催化(服用硝酸甘油等)兩種途徑，NOS途徑指內毒素等刺激血管內皮細胞后被激活的NOS通過L-精氨酸轉變為L-瓜氨酸的過程產生維持正常生命所需的NO。NOS是調控NO合成的最重要蛋白，有3種不同存在形式(iNOS、eNOS和nNOS)，其中性質較為相似的兩種高度依賴Ca2+的蛋白質酶eNOS和nNOS又稱為cNOS。正常情況下cNOS體內含量較少，能夠產生供機體需要量的NO，低濃度的NO在體內可作為傳遞介質和調節介質傳遞信號，可促進外周血管舒張、維持血管的穩定，因而低濃度的NO對機體有保護作用。iNOS在生理狀態呈不表達或低表達狀態，SAP時在細胞因子TN F-α、干擾素、內毒素等的誘導下進行轉錄和翻譯，iNOS持續高表達產生大量NO[11]。高濃度的NO不僅具有強烈擴血管作用，擴張外周血管增加通透性，通過誘導NF-κB產生大量炎癥因子，引起更嚴重的全身炎癥反應[12]，同時高濃度NO還可增強線粒體酶活性產生細胞毒性作用，甚至可以通過抑制DNA復制和三羧酸循環中部分關鍵酶引起DNA復制障礙及能量代謝紊亂。由此可見，NO在不同濃度下對SAP起著完全相反的調節作用，高濃度的NO通過不同機制可對機體造成嚴重損害，而低濃度NO卻可以維持機體穩態。在本實驗中，空白組NO含量始終處于較低水平，說明生理狀態下低濃度的NO有利于機體穩態的維持。SAP組NO含量明顯高于其他兩組，i NOS活性亦明顯高于其他兩組，證明了i NOS被誘導激活后可產生高濃度的NO造成嚴重組織損傷。治療組NO含量、i NOS和e NOS含量處于其他兩組之間，說明了大鼠治療有效與降低SAP大鼠體內NO含量相關。Apelin-13分子作用機制至今尚未完全闡明，但其擁有著十分廣泛的生物學作用，可啟動Apelin/APJ系統，在中樞和外周發揮其調節體液平衡、擴血管、降血壓、促進血管生成、促消化、抗炎并可抑制凋亡等作用，因此Apelin-13有著廣闊的發展空間和重要的研究意義。

本實驗通過外源性Apelin-13治療SAP模型大鼠了解了外源性Apelin-13對于SAP大鼠的治療效果極其可能機制。通過單純組、SAP組及治療組三組間下腔靜脈血淀粉酶、IL-6、 TN F-α、NO濃度及胰腺組織勻漿中i NOS、e NOS含量的對比與HE染色結果，進一步明確外源性Apelin-13對SAP的治療效果。結果顯示：SAP組大鼠胰腺靜脈血中血淀粉酶、IL-6、TN F-α、NO濃度與組織中i NOS均高于單純組，eNOS則低于單純對照組。Apelin-13治療組中靜脈血中血淀粉酶、IL-6、 TN F-α、NO濃度與組織中i NOS均高于單純對照組而低于胰腺炎組，eNOS則顯著高于其他兩組?？梢钥闯?，外源性Apelin-13對SAP治療效果明確，可能是通過干預體內iNOS激活誘導產生的NO含量及從而引起IL-6、 TN F-α等炎癥因子水平降低達到治療目的。

綜上所述，SAP進展過程中，iNOS活性不斷增高，eNOS活性不同程度的降低，體內NO含量明顯增多，加劇機體組織損傷。注射外源性Apelin-13治療后，治療組iNOS活性明顯降低，而eNOS活性則出現不同程度升高，iNOS激活產生的具有強烈組織損傷作用的NO大幅降低，而eNOS催化的具有保護組織效用的NO有所提升，從而保護機體組織。外源性Apelin-13早期可以顯著下調大鼠血清淀粉酶、IL-6、TN F-α濃度，從而降低SAP大鼠炎癥損害改善胰腺組織的壞死進程。提示在SAP早期應及時治療，以降低炎癥損害，達到治療目的。