miR-335在子宮內膜癌患者血清中的表達及檢測臨床意義

馮苗苗,曹秋雨

廣州中醫藥大學第一附屬醫院婦科(廣州 510405)

子宮內膜癌是發生于子宮內膜的一組上皮性惡性腫瘤，好發于圍絕經期和絕經后女性[1]。在我國，子宮內膜癌的發病率呈逐年上升的趨勢，目前僅次于宮頸癌，居女性生殖系統惡性腫瘤的第二位，嚴重威脅患者的生命健康[2]。一般認為，子宮內膜癌按發病機制和生物學行為特點可分為雌激素依賴型(I型)和非雌激素依賴型(II型)[3]，但有關子宮內膜癌的確切發病機制迄今尚不清楚，故臨床尚無有效的預防策略，仍將重點應放在早期發現和早期治療上。miRNA是一類長度為18～24個核苷酸的內源性小RNA[4]，近年來的研究表明，miRNA參與細胞代謝、增殖、分化及凋亡等的調控，并與腫瘤的發生發展密切相關[5]。最近的研究發現，miR-335在多種生殖系統惡性腫瘤，如卵巢癌、宮頸癌及前列腺癌等中發揮重要作用[6]，因此，本研究旨在進一步探討miR-335在子宮內膜癌患者血清中的表達及其臨床意義，現報道如下。

資料與方法

1 一般資料 選取2017年8月至2018年4月我院收治的78例子宮內膜癌患者和70例健康婦女作為研究對象，其中子宮內膜癌組：年齡為41～73歲，平均年齡(52.6±7.3)歲，病理類型：子宮內膜樣癌62例，非子宮內膜樣癌16例，臨床分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期29例，Ⅲ期31例，Ⅳ期6例，患者均經組織病理學檢查確診為原發性子宮內膜癌，且均為初發病例，術前未接受放化療治療。正常對照組：年齡為39～71歲，平均年齡(51.3±6.5)歲，兩組患者的年齡等基本資料相比無統計學差異(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準，且研究對象均知情同意并簽署了知情同意書。

2 研究方法

2.1 儀器和試劑：熒光定量PCR測定儀、紫外分光光度計均購自Thermo Fisher公司；血清RNA提取試劑盒、逆轉錄酶試劑盒購自Invitrogen公司；miR-335引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Bulge-Loop miRNA qRT-PCR檢測試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司。

2.2 樣本收集：收集兩組的肘部外周靜脈血樣本3 ml，室溫靜置2～3 h，待血液完全凝固后，3000 r/min，4℃，離心10 min，將上層血清轉移至無RNA酶的EP管中，-80℃冰箱保存待檢。

2.3 RT-PCR：①取血清400 μl，嚴格按照血清RNA提取試劑盒說明書提取血清總RNA，應用紫外分光光度計檢測RNA的純度及濃度。②逆轉錄反應：嚴格按照逆轉錄試劑盒操作說明書進行操作，反應體系為20 μl，冰上依次加入以下試劑：總RNA 1 μl、10×RT buffer 1.5 μl、1 μmol/L逆轉錄特異性引物3 μl、50 U/μl MultiScribeTMReverse Transcriptase 1.0 μl、20 U/μl RNA酶抑制劑0.19 μl、100 mmol/L dNTPs 0.15 μl,加DEPC水補至20 μl。反應條件：37℃ 60 min，95℃ 5 min，產物置于-20℃保存。③實時熒光定量PCR：嚴格按照PCR試劑盒操作說明書進行PCR擴增。反應體系為20 μl，冰上依次加入以下試劑：逆轉錄產物cDNA 1 μl、引物1 μl、TaqMan GEx MASTER Mix 10 μl，加雙蒸水補至20 μl。反應條件：95℃反應20 s，95℃反應10 s，60℃反應20 s，共40個循環。④采用ΔCt值法對PCR結果進行分析，ΔCt值= Ct值(miR-320)- Ct值(內參基因)。

結 果

1 兩組血清miR-335相對表達量比較 子宮內膜癌組患者血清miR-335的相對表達量 (0.96±0.25)明顯低于正常對照組(1.92±0.57)(圖1),兩組相比差異具有統計學意義(P<0.05)。

注：與正常對照組相比，**P<0.05

2 子宮內膜癌患者血清miR-335相對表達量與其臨床病理特征的相關性分析 子宮內膜癌患者血清miR-335相對表達量與TNM分期、組織病理類型和淋巴結轉移密切相關(P<0.05)，而與患者的年齡、是否絕經、組織病理分級及CA125值無明顯相關性(P>0.05)，見表1。

3 ROC曲線分析 采用ROC曲線評價血清miR-335在子宮內膜癌中的診斷效能，其曲線下面積為0.793(95%CI：0.526～0.975)，診斷敏感性為89.43%，特異性為76.52%(圖2)。

圖2 血清miR-335對子宮內膜癌的診斷效能ROC曲線

討 論

miRNA是一類長度為18～24個核苷酸的內源性小RNA，具有高度的保守性，可負調控基因的表達[7]。研究表明，miRNA參與細胞發育、代謝、增殖、分化及凋亡等多種生理病理過程的調控，并與腫瘤的發生發展密切相關[8]。近年來報道顯示，血清中存在多種miRNA，其性質穩定，能耐受酸堿環境，不易被血液內源性或外源性RNases降解[9]，正常生理狀態下，miRNA在機體內的表達遵守嚴格的組織、時序特異性[10]，但在病理狀態下，miRNA可能發生異常表達[11]，因此，血清miRNA在腫瘤診斷中越來越受到重視。

表1 子宮內膜癌患者血清miR-335相對表達量與其臨床病理特征的相關性

子宮內膜癌是最常見的女性生殖系統腫瘤之一，該病對女性的生命安全與健康構成了嚴重威脅，其發病原因主要與長期持續的雌激素刺激、子宮慢性炎癥、月經紊亂及長期高脂肪飲食等因素有關[12-13]，然而，目前尚不清楚子宮內膜癌確切的發病機制。研究表明，子宮內膜癌中存在多種miRNA的異常表達，提示miRNA可能在子宮內膜癌的發生發展中發揮重要作用[14-15]。最近的研究發現，卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、肺癌、肝癌等腫瘤，尤其是在多種生殖系統惡性腫瘤中miR-335呈低表達，提示miR-335可能在一定程度上起著抑癌基因的作用[16-17]。然而，國內關于miR-335在子宮內膜癌中表達情況的報道較少，因此，本研究探討了血清miR-335在子宮內膜癌中的表達及其臨床意義。

本研究結果顯示，子宮內膜癌組患者血清miR-335的相對表達量明顯低于正常對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，這提示miR-335低表達可能在某種程度上促進子宮內膜癌的發生發展，miR-335表達水平顯著降低，可能是子宮內膜癌的一個重要生物標志物。進一步分析miR-335表達與子宮內膜癌臨床病理特征相關性，結果發現，子宮內膜癌患者血清miR-335相對表達量與TNM分期、組織病理類型和淋巴結轉移密切相關(P<0.05)，而與患者的年齡、是否絕經、組織病理分級及CA125值無明顯相關性(P>0.05)，這提示血清miR-335表達不易受個體因素或其他因素影響，其對子宮內膜癌的組織病理類型、疾病進展及淋巴結轉移判斷具有一定的臨床價值。由ROC曲線圖可知，血清miR-335對子宮內膜癌的診斷敏感性和特異性均較高，以上研究結果提示，血清miR-335可能是子宮內膜癌早期診斷的潛在標志物和治療新靶點，尤其可以彌補CA125等傳統血清腫瘤標志物在早期診斷中的不足。

綜上所述，miR-335在子宮內膜癌患者血清中呈低表達，且其表達水平與子宮內膜癌的發生發展密切相關，miR-335可能成為診斷子宮內膜癌的潛在標志物和治療新靶點。存在的不足之處，本次研究納入的樣本量較少，今后應擴大樣本量的收集，以進一步研究miR-335與子宮內膜癌發生發展的關系，以期為子宮內膜癌的臨床診治提供更有價值的參考依據。