Box-Behnken效應面法優化板藍根總黃酮的超聲提取工藝及其抗氧化活性研究

梁艷妮，朱 佳，唐志書，孫曉春，劉世軍，宋忠興，王 征

（陜西中醫藥大學/陜西省中藥資源產業化協同創新中心，陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712083）

板藍根為十字花科植物菘藍Isatis indigotica Fort.的干燥根，主產于江蘇、河北，具有清熱解毒、涼血利咽作用[1]。臨床常用于溫疫時毒，發熱咽痛、流行性感冒、腮腺炎、急性扁桃體炎等病癥，具有抗病毒、抗菌、抗炎、鎮痛等藥理作用[2]。板藍根證實含有生物堿、木質素、神經酰胺、黃酮、有機酸類、蒽醌類、芥子苷類等近百個化合物[3-6]。有關板藍根總生物堿及多糖的提取工藝研究較多[7-8]，但對于板藍根黃酮的提取工藝研究僅有一篇[9]。黃酮類化合物因具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等多種生物活性受到廣泛關注[10]。超聲波提取法具有能耗低、效率高和不破壞黃酮分子結構等優點[10-11]。Box-Behnken效應面法采用多項式擬合各因素與響應值之間的函數關系，比正交實驗設計結果更優良[12-13]。本實驗擬通過單因素試驗與響應面分析法優化板藍根總黃酮的超聲乙醇提取工藝，為板藍根總黃酮的藥理活性研究與開發提供參考。

1 材料

板藍根（批號：20171101，產地河北）為十字花科植物菘藍Isatis indigotica Fort.的干燥根，購于陜西興盛德藥業有限責任公司，由陜西中醫藥大學王繼濤高級實驗師鑒定。蘆丁對照品（批號：wkq16031602，純度：HPLC≥98%），購自四川省維克奇生物科技有限公司；所用試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

UV-2600型紫外分光光度計（日本島津公司）；KQ-300DE型數控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；GB204 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；FA2004B型萬分之一電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；VaCo5低溫冷凍干燥儀（Zibrus Technology）；HH-2型恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；FE-1000AD固體粉碎機（天津鑫博得儀器有限公司）。

2 方法

2.1 標準曲線的制作 以蘆丁為對照品采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法繪制標準曲線[14]。即精密稱取蘆丁對照品適量，60%乙醇溶解配制200 μg/mL的蘆丁對照品溶液。精密量取1 mL，2 mL，4 mL，6 mL，8 mL的對照品溶液分別置于25 mL容量瓶中，以空白為對照，加60%乙醇至8 mL振搖，各加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，振搖，靜置6 min；各加10%硝酸鋁溶液1 mL，振搖，靜置6 min；各加4%氫氧化鈉溶液4 mL，60%乙醇定容，搖勻，靜置15 min，在波長510 nm測定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線得線性回歸方程 ：Y = 12.434 X- 0.003 5（r = 0.999 8），線性范圍：8 ～ 64 μg/mL。

2.2 板藍根總黃酮提取單因素試驗 將干燥板藍根藥材粉碎，精確稱取干燥的板藍根粉末5 g于250 mL三角瓶中，在考察提取因素條件下（料液比、提取時間和乙醇濃度）加入乙醇水溶液，超聲提取[11]（固定功率為300 W，提取溫度為室溫）一定時間，過濾，石油醚萃取后將下層溶液旋轉蒸發濃縮至無水狀，60%乙醇定容，搖勻為待測液，按照“2.1”項下方法測定吸光度，根據蘆丁標準曲線計算總黃酮提取率，確定各因素適宜提取條件。

2.3 Box-Behnken響應面試驗設計 根據單因素試驗篩選的料液比、乙醇濃度和提取時間，采用Design-Expert. V8.0.6軟件中Box-Behnken模型設計試驗組，以料液比（A）、提取時間（B）、乙醇濃度（C）三個因素為自變量，將板藍根總黃酮提取率作為響應值，進行響應面分析。Box-Behnken試驗設計因素水平表見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平表

2.4 抗氧化活性測定 將采用最佳工藝提取的板藍根粗黃酮配成質量濃度為12 mg/mL的水溶液，膜壓差為80 kPa過0.2 μ陶瓷膜純化除雜后作抗氧化活性測定。

2.4.1 DPPH·清除活性 按照陳智坤等[15]清除DPPH·的方法，向6支試管中分別加入 2 mL 6 mmol/L的DPPH· 乙醇溶液和2 mL 系列濃度的板藍根黃酮乙醇溶液，充分混合，室溫避光反應 30 min后測定在 517 nm處的吸光度 A實驗；以等體積的無水乙醇代替板藍根黃酮溶液測得吸光度為 A空白；以等體積的無水乙醇代替 DPPH·乙醇溶液測得吸光度為 A對照。DPPH·清除能力計算公式為：清除率（%）= [1 -（A實驗- A對照）/A空白]×100%。

2.4.2 ·OH清除活性 參考汪荔等[16]清除·OH的方法，在6支試管中分別依次加入 6 mmol/L FeSO4溶液2 mL，不同質量濃度板藍根黃酮溶液 2 mL，6 mmol/L H2O2溶液2 mL，搖勻，靜置 10 min后再加 6 mmol/L水楊酸溶液 2 mL，搖勻，水浴 37 ℃保溫 30 min 后于510 nm 處測得不同黃酮濃度下的吸光度 Ai；用水代替水楊酸乙醇溶液時測得本底吸光度 Aj，用水代替黃酮溶液是測得空白對照吸光度 A0。·OH清除率（%）= [1-（Ai-Aj）/A0] ×100%。

3 結果

3.1 單因素試驗

3.1.1 料液比對板藍根總黃酮提取率的影響 在超聲功率300 W，乙醇濃度60%，提取20 min條件下考察料液比 1：10，1：15，1：20，1：25，1：30，1：35 對黃酮提取率的影響。從圖1可以看出，板藍根黃酮提取率隨提取溶劑用量增大先增大后減小，在料液比為1：25時，總黃酮提取率最大。

圖1 料液比對總黃酮提取率的影響

3.1.2 乙醇濃度對板藍根總黃酮提取率的影響 在超聲功率300 W，料液比1：25，提取20 min條件下考察30%，40%，50%，60%，70%，80%乙醇對總黃酮提取率的影響。從圖2可以看出，板藍根黃酮提取率隨乙醇濃度增大先增大后減小，提取溶劑濃度與總黃酮極性相關，乙醇濃度為60%時總黃酮提取率最大。

圖2 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

3.1.3 提取時間對板藍根總黃酮提取率的影響 在超聲功率300 W，料液比1：25，乙醇濃度60%條件下考察超聲10，15，20，25，30，35 min對總黃酮提取率的影響。從圖3可以看出，超聲時間對總黃酮的提取率影響也存在極值范圍，隨著超聲時間延長雜質溶出量增大，超聲時間20 min時總黃酮提取率最大。

3.2 響應面優化提取條件

3.2.1 響應面試驗設計 根據表1中3因素3水平編碼設計試驗方案，結果見表2，方差分析結果，見表3。

圖3 提取時間對黃酮提取率的影響

表2 Box-Behnken試驗設計與結果

通過Design-Expert.V8.0.6軟件進行回歸分析，得到料液比、乙醇濃度和超聲時間對板藍根總黃酮提取率影響的二次多項回歸方程：Y = 2.71-0.074A-0.047B-0.027C-0.018AB-0.16AC+0.029BC-0.20A2-0.099B2-0.15C2。從表3可知該模型極顯著（P＜0.0001），失擬項檢驗P = 0.0513＞0.05，說明失擬項不顯著。以上表明該二次方程模型擬合度好，實驗誤差小，能夠準確反映3因素對板藍根總黃酮提取率的影響，可以利用此模型對板藍根總黃酮的超聲提取工藝進行優化分析。從表3可看出，一次項A，B，C，交互項AC，BC，二次項A2，B2，C2對響應值影響極顯著，僅交互項AB影響顯著。比較各項F值可知各因素對響應值的影響大小為A＞B＞C，即料液比＞提取時間＞乙醇濃度。

表3 響應面回歸模型方差分析

3.2.2 響應面圖分析 通過多元回歸方程作三維效應曲面圖和二維平面等高線圖，從圖4-6可以直觀分析三個因素之間的交互作用以及對總黃酮提取率的影響。

圖4 料液比與提取時間對板藍根黃酮提取率的響應面圖和等高線圖

圖5 料液比與乙醇濃度對對板藍根黃酮提取率的響應面圖和等高線圖

圖6 提取時間與乙醇濃度對板藍根黃酮提取率的響應面圖和等高線圖

由圖4料液比與提取時間交互作用顯示，料液比變化曲面比提取時間變化曲面陡峭；等高線沿料液比方向變化稍高于提取時間方向且呈橢圓形，表明料液比對響應值的影響比提取時間稍大，二者之間交互作用顯著。由圖5料液比與乙醇濃度交互作用顯示，料液比變化曲面比乙醇濃度變化曲面稍陡峭；等高線沿料液比方向變化稍高于乙醇濃度方向且呈橢圓形，表明料液比對響應值的影響比乙醇濃度大，二者交互作用極顯著。由圖6提取時間與乙醇濃度交互作用顯示，提取時間與乙醇濃度對響應值的影響相當，二者交互作用極顯著。

3.2.3 試驗驗證 根據響應面分析確定超聲提取板藍根總黃酮的最佳工藝參數為：料液比為1：29，提取時間為18 min，乙醇濃度為55%，對應總黃酮提取率為2.60%。用上述最佳工藝進行驗證試驗，總黃酮三次平均提取率為2.56%，與預測值的相對誤差為1.5%，說明所得最佳工藝條件穩定，具有實用價值。

3.3 抗氧化活性

3.3.1 板藍根黃酮對DPPH·清除作用 從圖7可看出板藍根黃酮對DPPH·的清除率隨著濃度增大而增強，在2～20 mg/mL范圍內呈一定量效關系。當板藍根總黃酮質量濃度為20 mg/mL時清除率達80.30%。

圖7 不同濃度板藍根總黃酮對DPPH·的清除作用

3.3.2 板藍根黃酮對·OH清除作用 從圖8可看出板藍根黃酮對·OH的清除率隨著濃度增大而增強，在2～20 mg/mL范圍內呈一定量效關系。當板藍根總黃酮質量濃度為20 mg·mL-1時清除率達82.40%。

圖8 不同濃度板藍根總黃酮對·OH的清除作用

4 討論

在提取工藝參數的優化中，影響因素和響應值之間往往具有高度非線性關系，響應面法通過設計有限次數試驗，建立包括各因素一次項、平方項和交互項的多元二次模型，擬合因素與響應值間的全局函數關系。對影響響應值的各因素水平及其交互作用進行優化和評價，可快速有效地確定多因素影響的最佳條件，精度高，預測性好。本研究在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken效應面法設計試驗以優化板藍根總黃酮的超聲提取工藝，建立的二次多項回歸模型極顯著，失擬項不顯著，擬合度好，能夠準確地反映料液比、乙醇濃度和提取時間對板藍根總黃酮提取率的影響。利用此模型得到的板藍根總黃酮超聲提取最佳條件為料液比1：29，提取時間18 min和乙醇濃度55%，提取時間短，方法簡便，黃酮提取率可達2.60%。由驗證試驗可知Box-Behnken效應面法得到的理論優化結果可靠。采用非線性擬合模型接近客觀事實，效應面三維圖使因素對指標的影響更為直觀、方便。

0.2 μm陶瓷膜分離純化后的板藍根總黃酮對DPPH·和·OH的清除能力具有濃度依賴性，總黃酮濃度在20 mg/mL時對此2種自由基的清除率可達80%以上。板藍根黃酮的強抗氧化性為其進一步的開發提供了理論依據。