慢性疼痛對孕鼠及其子代認知功能的影響

周芳，李清，閆文靖，劉玉平，涂淑敏

(1.徐州醫科大學 護理學院，江蘇 徐州 221004； 2.徐州醫科大學附屬醫院 護理部，江蘇 徐州 221002；3.北京清華長庚醫院 麻醉科，北京 102218)

慢性疼痛是指持續或間歇性地持續3個月以上的疼痛[1]，在普通人群中的發生率為20%～45%[2]。本課題組前期研究發現，44.2%的妊娠期女性發生慢性疼痛，其中53.3%的人出現抑郁，30.4%的人出現焦慮癥狀[3]。在動物實驗中，我們發現孕期慢性疼痛的孕鼠體重增加值顯著低于對照組孕鼠，且有早產情況，其平均孕期、產仔數均低于對照組，但活產率及子代性別比與對照組相比無統計學差異[4]。除此以外，慢性疼痛還常伴有認知功能的改變，如學習、記憶障礙，近80%的慢性疼痛患者認為自己記憶力減退[5]。母體妊娠期慢性疼痛是否會出現認知功能減退？其子代認知功能是否也會受到影響？至今還未有報道。

本研究擬通過構建孕期小鼠慢性炎性痛模型，觀測慢性疼痛對孕鼠及其子鼠認知功能的影響，以揭示孕期慢性疼痛對母體和子代健康的危害。

1 材料與方法

1.1 材料

選用未受孕過的SPF級昆明小鼠(由徐州醫科大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK 2002- 0038)，65～80日齡，雌性，體重33～35 g，同批交配。10～12 h后陰道栓或陰道涂片發現精蟲者定為妊娠第0天。選取30只成功受孕小鼠，隨機分為正常組、假手術組和慢性疼痛組，每組10只。子鼠出生后剔除死胎、發育畸形、先天殘疾小鼠后對其進行編號，用隨機數表法分別選出正常組子鼠、假手術組子鼠和慢性疼痛組子鼠，各10只。所有子代小鼠均按常規方式飼養。

1.2 方法

1.2.1 孕鼠慢性疼痛模型的制備 慢性關節炎疼痛模型：母鼠交配成功后，在異氟醚麻醉下圍繞左后足的足跖關節處選擇兩點，皮內注射無菌完全弗氏佐劑(CFA)100 μl(即500 μg)，誘導產生關節炎性痛。在注射后24 h即出現熱痛覺閾值的降低并可維持4周以上，持續整個孕期(22 d左右)至產后1周。在造模后第1、7、14、21天及產后第7天分別監測模型組小鼠痛閾值，疼痛敏感性降低(熱縮足潛伏期延長)的小鼠追加注射CFA 1次，確保在造模后的28 d內慢性疼痛組小鼠維持穩定的較低痛閾值(始終處于疼痛狀態)。

假手術組母鼠用同樣麻醉方式、同樣注射方法、同樣注射部位注入同體積無菌PBS。正常組常規飼養，不作任何處理。

1.2.2 孕鼠及其子鼠認知行為監測 用Morris水迷宮實驗(包括定位航行和空間搜索實驗)檢測母鼠及子鼠認知(學習和記憶)功能。各組孕鼠在造模后6～12 d測試，各組子鼠分別于出生后3周(幼年期，可離乳獨立生活)、6周(青春期)、9周(成年期)測試。

定位航行實驗：用于檢測學習能力。實驗時平臺固定在NW象限，位于水面下1 cm。實驗歷時6 d，訓練第1天(造模后第6天)讓小鼠自由游泳1 min；從第2天(造模后第7天)起，每天每只小鼠測試4次，每次將小鼠面向池壁輕放入水中。第1次和第4次從目標象限對側的象限(SE)入水，第2次和第3次隨機從SW和NE象限入水。小鼠游泳的監測時間為120 s，計算機采集系統自動記錄從小鼠入水到找到隱藏平臺的數據和過程，從小鼠入水到找到平臺的時間記為逃避潛伏期。如小鼠在60 s內未找到平臺，須將其引至平臺，這時潛伏期計為60 s。取小鼠4次潛伏期的算術平均數作為當天的平均逃避潛伏期。每次訓練完，用干毛巾將小鼠擦干，以防止低體溫造成的應激，讓小鼠休息60 s后開始下一次訓練。

空間搜索實驗：用于檢測記憶能力。在定位航行試驗結束后(訓練第7天，即造模后第12天)撤除平臺，從SE象限將小鼠放入水中，記錄小鼠60 s內搜尋平臺的運動軌跡、在原平臺所在象限的停留時間、游程占總時間(時間比率)和總游程(游程比率)的百分比、平均游速及穿越原平臺區的次數。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 疼痛模型效果檢測

采用熱縮足潛伏期檢測判斷動物疼痛閾值變化,結果見圖1A。由圖1A可見，造模后第1至28天，慢性疼痛組孕鼠在各時間點熱縮足潛伏期均顯著低于假手術組孕鼠，提示造模后孕鼠在整個孕期及產后早期始終處于疼痛狀態(P<0.001)。慢性疼痛組孕鼠熱縮足潛伏期在各時間點差異無統計學意義(P>0.05)，提示孕鼠整個孕期疼痛較為穩定。以上結果提示疼痛模型造模成功。

2.2 慢性疼痛對母鼠認知行為的影響

在定位航行實驗中，經過第1天的熟悉環境后，第2天各組孕鼠均能在60 s內找到平臺，各組平均逃避潛伏期差異無統計學意義(P>0.05)。第3天至第6天，孕鼠平均逃避潛伏期慢性疼痛組均長于假手術組孕鼠(P<0.001)，見圖1B。在空間搜索實驗中，孕鼠穿越平臺次數、平均游速、在原平臺象限停留的時間比率及游程比率慢性疼痛組均顯著低于假手術組(P<0.05)，見表1。

2.3 慢性疼痛對子鼠認知行為的影響

見圖1C及表2。

與假手術組孕鼠或子鼠比較，aP<0.001，bP<0.01

A.孕鼠熱縮是潛伏期檢測；B.孕鼠平均逃避潛伏期檢測；C.子鼠出生后第3周平均逃避潛伏期檢驗

圖1各組孕鼠、子鼠行為學比較

表1各組孕鼠空間搜索能力比較(n=10)

組 別平均游速/cm·s-1穿越平臺數/次·(60 s)-1時間比率/%游程比率/%正常組20.19±0.884.59±1.2342.31±3.8545.13±2.79假手術組22.20±1.864.71±0.8738.04±4.1642.73±3.12慢性疼痛組19.35±1.47a1.18±1.29b26.36±3.97c24.66±2.21b

與假手術組比較，aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001

表2各組子鼠出生后3周空間搜索能力比較(n=10)

組 別平均游速/cm·s-1穿越平臺數/次·(60 s)-1時間比率/%游程比率/%正常組19.33±1.674.32±1.5739.47±4.1743.29±3.54假手術組20.79±1.624.26±1.2140.33±4.2843.87±3.58慢性疼痛組19.52±1.333.19±1.53a39.31±3.8642.15±3.16

與假手術組比較，aP<0.05

由圖1C可見,在子鼠出生的第3周期間，慢性疼痛組子鼠平均逃避潛伏期顯著長于假手術組子鼠(P<0.01)。在出生后第6周和第9周，兩組子鼠平均逃避潛伏期無統計學差異(P>0.05)。在空間搜索實驗中，出生后第3周慢性疼痛組子鼠穿越平臺次數少于假手術組子鼠(P<0.05)，平均游速、在原平臺象限停留的時間比率和游程比率與假手術組子鼠比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。至其出生后第6周和第9周，各組子鼠在定位航行實驗和空間搜索實驗中各項監測指標均無統計學差異(P>0.05)。

3 討 論

國際疼痛研究協會將疼痛定義為一種與組織損傷或潛在組織損傷相關的感覺、情感、認知和社會維度的痛苦體驗[6]。與疼痛的感覺相比，有關疼痛狀態下認知功能的減退一直沒有得到足夠的關注，這也是臨床治療中常被忽視的部分。本研究結果顯示，孕期慢性疼痛可導致孕鼠認知能力下降。有研究指出，認知能力減退主要與患者慢性疼痛強度、負性情緒和鎮痛藥的使用等有關[7]。本課題組前期研究發現，無論是人類孕婦還是懷孕小鼠，如罹患慢性疼痛均會出現抑郁[3,8]。因此我們推測，本研究中母鼠認知能力的下降與其慢性疼痛的持續存在有關，也可能與慢性疼痛導致的抑郁情緒有關。

關于慢性疼痛導致認知障礙的機制，Van Ryckeghem提出，學習記憶、抑郁和疼痛在腦內調控過程中是競爭關系，當慢性疼痛引發負性情緒出現時，涉及信息加工整合的記憶功能就會受影響[9]。已有研究表明，疼痛與記憶、抑郁存在共同的中樞神經通路，與疼痛有關的中樞神經結構如前額葉皮質、杏仁核、丘腦、海馬等腦區，同時也是記憶神經通路的一部分，在焦慮抑郁的發生過程中也起到一定的作用[10]。此外，疼痛、抑郁和記憶所涉及的邊緣神經網絡系統也存在部分重疊現象，神經影像學研究證實，這些區域在疼痛、抑郁和記憶的加工過程中被激活[11]。因此，未來關于慢性疼痛導致負性情緒、認知障礙機制的研究，從神經環路機制著手可能是比較合理的做法。

本研究還發現，在子鼠出生后3周的定位航行實驗中，慢性疼痛組子鼠的學習能力顯著差于假手術組子鼠，而在其出生后6、9周的定位航行實驗中，各組子鼠學習能力無統計學差異。提示子鼠在出生后早期有一定程度的學習障礙，但隨著生長發育逐漸成熟，其學習能力可恢復至與正常小鼠無異。我們曾經報道孕期慢性疼痛可導致其新生鼠的尾長、體重及行為表征(平面翻正達標率、爬行達標率)顯著差于正常組新生鼠[4]。但慢性疼痛組子鼠出生后第3周在空間搜索實驗中，其平均游速與假手術組子鼠相比無差異，說明其水中運動能力與正常小鼠相比無顯著性差異，這提示胎內發育不良在成長過程中有逐漸改善的可能。

水迷宮實驗對嚙齒類動物認知功能檢測具有良好的可信性[12]，在較多慢性疼痛研究中亦有應用[13]。本研究中慢性疼痛模型是小鼠左后足足跖關節炎癥模型，肢體疼痛對動物的運動可能會有一定的影響。但本研究定位航行實驗測試的第1天，各組孕鼠均能在60 s內找到平臺，各組平均逃避潛伏期差異無統計學意義(P>0.05)。說明本實驗條件下，后足痛對孕鼠在水中運動能力的影響并沒有顯著干擾水迷宮對其認知能力測試的可信性。但是研究者應尋求更加科學合理的認知檢測方法，最大程度地避免運動能力受限有可能對認知功能檢測帶來的干擾。

綜上所述，孕期慢性疼痛會導致母體認知能力的下降，也可能會影響其子代早期的腦認知功能。人們對于慢性疼痛的研究應關注到孕婦這一特殊人群，對于慢性疼痛機制的研究不應局限于疼痛本身，對慢性疼痛引發的抑郁焦慮、認知功能下降的發生機制也應當予以足夠的重視。