脂肪酸環(huán)氧化酶SlEPX轉(zhuǎn)基因大豆的表型分析

郝青婷，張飛，吉夏潔，薛金愛(ài)，李潤(rùn)植

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脂肪酸環(huán)氧化酶轉(zhuǎn)基因大豆的表型分析

郝青婷，張飛，吉夏潔，薛金愛(ài)，李潤(rùn)植

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西太谷 030801）

【目的】植物源環(huán)氧化脂肪酸（epoxy fatty acids，EFAs）是生產(chǎn)高值化工產(chǎn)品的優(yōu)異可再生原材料。EFAs僅在一些野生植物種子中高水平合成和積累，難以規(guī)?；?。通過(guò)在普通油料作物大豆（(L.) Merr.）發(fā)育種子中組裝環(huán)氧化脂肪酸合成途徑，以期實(shí)現(xiàn)這類珍稀脂肪酸（unusual fatty acids，UFAs）的商業(yè)化綠色生產(chǎn)?！痉椒ā客ㄟ^(guò)構(gòu)建琉璃菊（）脂肪酸環(huán)氧化酶（，）基因種子特異表達(dá)載體，基于體細(xì)胞胚發(fā)生的粒子轟擊法對(duì)大豆（cv. Jack）進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)連續(xù)選擇和鑒定，獲得表型穩(wěn)定的高代轉(zhuǎn)基因大豆株系。分別運(yùn)用PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)外源基因的整合及在大豆發(fā)育種子中的表達(dá)譜。統(tǒng)計(jì)分析轉(zhuǎn)基因大豆籽粒形態(tài)和大小、百粒重以及種子萌發(fā)率等表型，應(yīng)用氣相色譜和凱氏定氮法測(cè)試種子油脂和蛋白等相關(guān)生理生化特性。【結(jié)果】外源基因穩(wěn)定整合于大豆基因組，且能在高代轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)育種子中正確有效表達(dá)。轉(zhuǎn)基因大豆種子新合成積累了2.9%的EFAs，相應(yīng)的亞油酸（18﹕2Δ9,12）含量減低8%。與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因大豆種子變長(zhǎng)，表皮多皺褶。種子大小測(cè)量顯示，轉(zhuǎn)基因大豆小粒種子（粒徑＜4 mm）占比明顯增加。轉(zhuǎn)基因與對(duì)照大豆的種子發(fā)芽率無(wú)明顯差異，然而轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)緩慢。轉(zhuǎn)基因大豆種子油脂含量、蛋白質(zhì)含量和百粒重分別減少5%、6%和8.28%。進(jìn)一步生化分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因大豆新合成的EFAs，絕大部分結(jié)合于卵磷脂（phosphatidylcholine，PC，占12.6%）分子，僅少量結(jié)合于甘油三酯（triacylglycerol，TAG，占2.3%）。這些數(shù)據(jù)表明在轉(zhuǎn)基因大豆種子中，外源SlEPX酶能正確催化亞油酸（18﹕2Δ9,12）生成環(huán)氧化脂肪酸即斑鳩菊酸（vernolic acid，Va）(12-epoxy-18﹕1Δ9）。但是，絕大多數(shù)斑鳩菊酸積累于構(gòu)成細(xì)胞膜的主要成分PC分子中，而沒(méi)有轉(zhuǎn)移整合進(jìn)入貯藏的TAG分子。大量新合成的斑鳩菊酸結(jié)合于PC分子可能損傷宿主細(xì)胞膜穩(wěn)態(tài)和生理反應(yīng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)生不利表型?！窘Y(jié)論】在大豆發(fā)育種子中單獨(dú)表達(dá)外源脂肪酸環(huán)氧化酶，能催化合成少量EFAs，但同時(shí)產(chǎn)生一些不利表型。在轉(zhuǎn)基因大豆種子中共表達(dá)或，既可實(shí)現(xiàn)環(huán)氧化脂肪酸在TAG中富集，同時(shí)還能消除環(huán)氧化脂肪酸在細(xì)胞膜中的積累及其所導(dǎo)致的負(fù)效應(yīng)。

大豆；環(huán)氧化脂肪酸；環(huán)氧化酶；轉(zhuǎn)基因大豆；表型分析

0 引言

【研究意義】油料作物的種子不僅是食用油的主要來(lái)源，亦是日益重要的可再生優(yōu)質(zhì)原料，用于生物柴油和各種油脂化工品的商業(yè)化生產(chǎn)[1-2]。普通油料作物的種子油包含5種常見(jiàn)的脂肪酸﹕棕櫚酸（16﹕0）、硬脂酸（18﹕0）、油酸（18﹕1Δ9）、亞油酸（18﹕2Δ9,12）和亞麻酸（18﹕3Δ9,12,15），這些脂肪酸已廣泛應(yīng)用于食品和其他工業(yè)。然而，很多未商業(yè)化的野生植物種子能合成和高水平積累一些稀有脂肪酸（unusual fatty acids，UFAs），如羥化脂肪酸、環(huán)氧化脂肪酸、乙炔酸脂肪酸和共軛脂肪酸等[3]。它們是油漆、涂料、黏合劑、增塑劑等化工產(chǎn)品的可再生優(yōu)質(zhì)原材料，具有獨(dú)特的商業(yè)價(jià)值[4]。例如，蓖麻（L.）種子中積累的蓖麻油酸高達(dá)總脂的90%[5]，斑鳩菊（）和琉璃菊（）種子中的環(huán)氧化脂肪酸的含量約為總脂的80%[6-7]。但是，由于這些植物存在種子小、產(chǎn)量低、可種植地理區(qū)域有限等不良農(nóng)藝性狀，使得這些稀有脂肪酸難以商業(yè)化生產(chǎn)以滿足工業(yè)化應(yīng)用的需求。因此，越來(lái)越多的研究聚焦于使用基因工程手段在普通油料作物種子中組裝這些UFA的合成途徑，以期實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。大豆是中國(guó)及世界主要栽培油料作物之一，全球種植廣泛，面積大，產(chǎn)量高[8]。大豆油的產(chǎn)量是世界植物油總產(chǎn)量的30%[9]。近年來(lái)由于生物柴油的興起，大豆作為一種優(yōu)質(zhì)的生物燃油工業(yè)原料也成為研究熱點(diǎn)之一。自2010年栽培大豆和野生型大豆基因組序列相繼問(wèn)世以來(lái)[10]，在基因水平改造大豆的技術(shù)越來(lái)越成熟，研究周期也大幅縮短，有助于人類選育更符合要求的大豆品種?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】已有一些研究聚焦于在大豆種子中組裝相關(guān)油脂合成途徑，建立利用普通油料作物種子為平臺(tái)，以期商業(yè)化生產(chǎn)各種高值珍稀脂肪酸。例如，棕櫚油酸（16﹕1Δ9）是一種高值健康型珍稀脂肪酸，大豆種子不能合成這種脂肪酸，但含有它的前體物質(zhì)棕櫚酸（16﹕0）。表達(dá)源于哺乳動(dòng)物的CoA-Δ9脫氫酶基因可使大豆種子棕櫚酸的一半轉(zhuǎn)化成棕櫚油酸，含量達(dá)10%，而棕櫚酸含量則從25% 降低到5%[11]。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)李潤(rùn)植課題組與美國(guó)肯塔基大學(xué)Hildebrand實(shí)驗(yàn)室先前合作研究從一種平菇（）中分離到CoA-Δ9脫氫酶基因，用種子特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)該基因在大豆體細(xì)胞胚中表達(dá)，獲得棕櫚油酸含量高達(dá)14%的轉(zhuǎn)化體[12]。長(zhǎng)鏈ω-3多不飽和脂肪酸EPA （20﹕5）和DHA（22﹕6）是人類必須從食物中獲取的健康型脂肪酸，普通油料作物種子不能合成。Kinney等[13]在大豆種子中成功組裝了EPA和DHA合成途徑，共表達(dá)7個(gè)相關(guān)基因（Δ6脫氫酶、Δ6延長(zhǎng)酶、Δ15脫氫酶和Δ17脫氫酶等），轉(zhuǎn)基因種子含EPA和DHA分別達(dá)20%和2.3%。環(huán)氧化脂肪酸（epoxy fatty acids，EFAs）是在?；溕系膯蝹€(gè)或多個(gè)位置處含有跨越相鄰碳原子的氧橋，使得它們具有高反應(yīng)性并易于交聯(lián)，用于多種高值化工品的生產(chǎn)[14-16]。工業(yè)上，植物油脂可經(jīng)一系列化學(xué)反應(yīng)生成各種環(huán)氧化脂肪[17-18]。相關(guān)研究表明，EFAs的生物合成是由2種類型的脂肪酸環(huán)氧化酶（P450型-環(huán)氧化酶和FAD2型-環(huán)氧化酶）催化的。脂肪酸環(huán)氧化酶以亞油酸（18﹕2Δ9,12）為底物，催化其碳鏈上Δ12位置處的雙鍵加入一個(gè)氧原子，生成具有1個(gè)氧橋和一個(gè)雙鍵的環(huán)氧化脂肪酸（12-epoxy-18﹕1Δ9），即斑鳩菊酸（Vernolic acid，Va）[19-20]。將來(lái)自于大戟屬植物的P450型-環(huán)氧化酶基因在大豆體細(xì)胞胚中表達(dá)，體細(xì)胞胚可合成8% Va[21]。將來(lái)自還陽(yáng)參屬植物的FAD2型-環(huán)氧化酶基因（2）在擬南芥種子中表達(dá)，Va合成積累達(dá)6.2%[22]。2表達(dá)也可使棉花種子中Va積累達(dá)8.3%[23]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前期研究已從高積累Va的琉璃菊（）發(fā)育種子中分離到編碼FAD2型-環(huán)氧化酶的[24]，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因擬南芥（）驗(yàn)證了SlEPX催化合成Va的酶活性。進(jìn)一步構(gòu)建了種子特異表達(dá)載體，采用基于體細(xì)胞胚的粒子轟擊法對(duì)大豆進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得種子特異表達(dá)大豆轉(zhuǎn)化體材料[25]，但轉(zhuǎn)基因遺傳穩(wěn)定性、表型及相關(guān)生理生化特征還未詳盡鑒定?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究經(jīng)連續(xù)選擇獲得表型一致、遺傳穩(wěn)定的高代轉(zhuǎn)基因大豆株系，重點(diǎn)鑒定和解析該基因種子特異表達(dá)所導(dǎo)致的大豆籽粒不利表型材料以及產(chǎn)生不利表型的分子機(jī)理。探討轉(zhuǎn)基因大豆種子出現(xiàn)負(fù)效應(yīng)的機(jī)制，以及進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)基因種子合成積累環(huán)氧化脂肪酸和減少負(fù)效應(yīng)的基因工程策略。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用目的基因來(lái)自高積累環(huán)氧化脂肪酸的琉璃菊（）的環(huán)氧化酶基因（GenBank accession，AY462108，1 137 bp），種子特異表達(dá)載體pCAMBIA1301含有種子特異性菜豆蛋白（Phaseolin）啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)盒及潮霉素（Hyg）抗性基因選擇標(biāo)記。轉(zhuǎn)基因受體種質(zhì)材料為大豆Jack品種。經(jīng)過(guò)基于體細(xì)胞胚發(fā)生的粒子轟擊法進(jìn)行大豆遺傳轉(zhuǎn)化。經(jīng)連續(xù)跟蹤選擇鑒定獲得第六代遺傳穩(wěn)定、表型一致的純合轉(zhuǎn)基因株系。

試驗(yàn)于2012年至2018年在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行，所有轉(zhuǎn)化載體和轉(zhuǎn)基因大豆材料保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所。

1.3 葉片DNA提取及PCR

田間種植非轉(zhuǎn)基因Jack品種大豆、空載體轉(zhuǎn)化大豆對(duì)照及環(huán)氧化酶轉(zhuǎn)基因的第六代大豆株系。在植株生長(zhǎng)處于幼嫩時(shí)期，采用傳統(tǒng)的CTAB法分別提取Jack及轉(zhuǎn)基因大豆的頂端嫩葉的DNA，以大豆Jack品種的非轉(zhuǎn)基因植株基因組為陰性對(duì)照、表達(dá)載體DNA為陽(yáng)性對(duì)照，用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表1），PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確定為轉(zhuǎn)基因的植株掛牌標(biāo)記，便于后期取樣。

1.4 種子總RNA提取及熒光定量PCR

分別提取轉(zhuǎn)基因植株葉片及3個(gè)發(fā)育時(shí)期（大豆植株開(kāi)花后7、20和35 d）的種子樣品，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1），以為內(nèi)參基因，參照GenStar說(shuō)明書(shū)配置熒光定量PCR體系，每個(gè)樣品6個(gè)重復(fù)，反應(yīng)程序?yàn)?5℃10 min；95℃15 s；60℃1 min，40個(gè)循環(huán)。

1.5 SlEPX轉(zhuǎn)基因種子3個(gè)發(fā)育時(shí)期TAG含量及脂肪酸成分的測(cè)定

分別將早期（開(kāi)花后12—15 d）、中期（25—35 d）、晚期（45 d）的Jack及轉(zhuǎn)基因種子研磨成粉末，并稱取10 mg樣品置于干燥玻璃試管中。參照張玲慧[26]方法進(jìn)行油脂和甲酯化的分析。甲酯化脂肪酸樣品置于GC瓶中，-20℃保存用于氣相檢測(cè)。使用安捷倫7890B氣相色譜儀檢測(cè)TAG中脂肪酸的成分和含量，色譜柱型號(hào)為：HP-88，階梯升溫程序?yàn)椋?40℃保持5 min，然后以2℃·min-1的速率上升至210℃，最后保持12.5 min；FID的溫度保持250℃。

1.6 斑鳩菊酸（Va）在SlEPX轉(zhuǎn)基因大豆種子不同脂類分子中的含量測(cè)定

將轉(zhuǎn)基因大豆成熟風(fēng)干的種子充分研磨，稱取適量樣品，加入氯仿﹕甲醇（2﹕1）混勻，離心后吸出底部的氯仿相，濃縮至50—100 μL后，通過(guò)薄層層析（thin-layer chromatography，TLC）將細(xì)胞內(nèi)不同類別的脂類分開(kāi)，2次的展開(kāi)劑分別為氯仿﹕甲醇﹕水（65﹕25﹕4）和正己烷﹕乙醚﹕乙酸（100﹕100﹕2）。將薄層板上的樣品條帶刮下轉(zhuǎn)移到帶玻璃纖維的吸管中，用氯仿﹕甲醇洗脫2次，將脂類樣品用氮?dú)獯蹈珊蠹尤爰状尖c進(jìn)行甲酯化反應(yīng)。甲酯化的樣品用于GC分析。

1.7 SlEPX轉(zhuǎn)基因大豆種子總脂含量測(cè)定

稱取50 mg野生型Jack和轉(zhuǎn)基因大豆成熟風(fēng)干的種子粗粉末，3個(gè)重復(fù)，加入石英砂充分研磨，先后分2次加入7.5 mL甲醇﹕氯仿（2﹕1），置于37℃的搖床分別抽提24 h，離心后收集上層有機(jī)相合并。加入5 mL氯仿、9 mL 1%的NaCl溶液，使得氯仿﹕甲醇﹕H2O為2﹕2﹕1.8，混勻后8 000 r/min離心10 min，收集下層有機(jī)相，氮?dú)獯蹈珊笥?jì)算脂肪酸的總重量。計(jì)算方法：總脂含量=[（提取后總重）-（提取前管重）]/0.05。

1.8 SlEPX轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)芽率、種子形態(tài)、百粒重及蛋白含量的檢測(cè)

百粒重測(cè)定：利用分析天平對(duì)非轉(zhuǎn)基因大豆Jack和轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行百粒重測(cè)定，至少6次重復(fù)。

發(fā)芽率測(cè)定：分別選取非轉(zhuǎn)基因大豆Jack和轉(zhuǎn)基因大豆150粒種子，放入鋪有專用發(fā)芽濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，50粒/皿，各設(shè)3個(gè)重復(fù)。置于20℃—25℃培養(yǎng)箱內(nèi)，發(fā)芽率測(cè)定期間，保持濾紙濕潤(rùn)。以胚根突破種皮，長(zhǎng)度達(dá)到種子長(zhǎng)度的1/2作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，從培養(yǎng)的第2天開(kāi)始統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)量，并將每天發(fā)芽的種子移出培養(yǎng)皿，直到再無(wú)種子萌發(fā)為止。計(jì)算方法：發(fā)芽率=（發(fā)芽種子總數(shù)）/（供試種子總數(shù)）×100%。

形態(tài)學(xué)觀察：利用體式顯微鏡對(duì)非轉(zhuǎn)基因大豆Jack和轉(zhuǎn)基因大豆的成熟種子進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

種子籽粒大小統(tǒng)計(jì)：隨機(jī)選取轉(zhuǎn)基因和空載體、非轉(zhuǎn)基因?qū)φ辗N子樣品，用一系列不同孔徑的篩子將不同大小種子分開(kāi)。分別統(tǒng)計(jì)各孔徑大小的種子所占比例，至少6次重復(fù)。

蛋白含量檢測(cè)：采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，至少6次重復(fù)。

所有設(shè)置重復(fù)的數(shù)據(jù)（脂肪酸含量、總脂含量、百粒重、發(fā)芽率及蛋白質(zhì)含量）均使用SPSS軟件進(jìn)行檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 高代轉(zhuǎn)基因大豆材料靶基因SlEPX整合及表達(dá)鑒定

以非轉(zhuǎn)基因大豆Jack（負(fù)對(duì)照）、轉(zhuǎn)基因大豆的葉片基因組及表達(dá)載體質(zhì)粒DNA（陽(yáng)性對(duì)照）為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖1）表明，對(duì)照J(rèn)ack植株基因組中未擴(kuò)增出環(huán)氧化酶片段，轉(zhuǎn)基因大豆基因組和表達(dá)載體質(zhì)粒DNA中分別擴(kuò)增出大小一致的目的條帶（1 137 bp），證明目的基因依然穩(wěn)定整合在所檢測(cè)的高代轉(zhuǎn)基因大豆基因組中。

表1 引物序列

通過(guò)對(duì)各樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)（圖2），目的基因在轉(zhuǎn)基因大豆種子3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，但在葉片中沒(méi)有表達(dá)，表明目的基因在種子中特異表達(dá)。在發(fā)育種子中的表達(dá)水平呈現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的拋物線型增長(zhǎng)，中期表達(dá)量最高，早期和晚期表達(dá)量低，并且中期的表達(dá)量是其他2個(gè)時(shí)期的2—3倍。這表明在高代轉(zhuǎn)基因大豆中，主要在轉(zhuǎn)基因大豆種子發(fā)育中期穩(wěn)定有效表達(dá)，而此時(shí)期正是大豆種子油脂高速積累期。

M：Marker；WT：非轉(zhuǎn)基因Jack植株；P：SlEPX表達(dá)載體質(zhì)粒DNA；1—4：SlEPX轉(zhuǎn)基因大豆株系

圖2 大豆種子不同發(fā)育時(shí)期SlEPX的表達(dá)分析

2.2 SlEPX轉(zhuǎn)基因大豆種子油脂肪酸成分分析

為檢測(cè)轉(zhuǎn)入大豆的編碼的脂肪酸環(huán)氧化酶是否能催化合成斑鳩菊酸（Va）以及是否對(duì)其他脂肪酸合成產(chǎn)生影響，運(yùn)用氣相色譜分析轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ辗N子不同發(fā)育時(shí)期樣品種子油脂肪酸成分，結(jié)果（圖3）顯示，非轉(zhuǎn)基因大豆Jack和轉(zhuǎn)基因大豆TAG中主要脂肪酸成分包括棕櫚酸（16﹕0）、硬脂酸（18﹕0）、油酸（18﹕1）、亞油酸（18﹕2）和亞麻酸（18﹕3）。轉(zhuǎn)基因大豆TAG中含有極少量的斑鳩菊酸（Va），僅占TAG總量的2.9%。與非轉(zhuǎn)基因大豆（空載體轉(zhuǎn)化體表型和非轉(zhuǎn)基因大豆表型一致，下同）相比，在轉(zhuǎn)基因大豆種子油脂中其他5種主要脂肪酸含量發(fā)生了明顯的變化。在種子發(fā)育中期和后期，轉(zhuǎn)基因種子油中亞油酸（18﹕2）含量顯著降低，亞麻酸（18﹕3）含量亦相應(yīng)減少。然而，油酸（18﹕1）含量卻增加。亞油酸（18﹕2）含量顯著減少，說(shuō)明轉(zhuǎn)入的編碼的環(huán)氧化酶正確行使功能，即以亞油酸（18﹕2Δ9,12）為底物，在Δ12位置的雙鍵處插入氧原子，生成斑鳩菊酸（Va）（12-epoxy-18﹕1Δ9）。亞油酸是亞麻酸的前體物質(zhì)，亞油酸減少必然導(dǎo)致亞麻酸含量減低。油酸（18﹕1）含量的升高，可能是導(dǎo)入的FAD-型環(huán)氧化酶（SlEPX）部分干擾了大豆本身正常的FAD2催化油酸生成亞油酸的功能。

2.3 SlEPX轉(zhuǎn)基因大豆種子新合成的斑鳩菊酸在不同脂類分子中的分布

為解析轉(zhuǎn)基因大豆種子油中斑鳩菊酸（Va）積累量較少的機(jī)理，應(yīng)用TLC對(duì)從種子萃取的總脂質(zhì)樣品進(jìn)行層析分離，分別收集TAG和PC脂質(zhì)分子樣品，甲酯化后進(jìn)行GC分析。結(jié)果（圖4）顯示，轉(zhuǎn)基因大豆TAG和PC脂質(zhì)分子均含有16﹕0、18﹕0、18﹕1、18﹕2、18﹕3和Va 6種脂肪酸。Va在TAG中的含量?jī)H為2.3%，比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于在PC分子中的含量（12.6%）。與此不同的是，在Va高積累的斑鳩菊和琉璃菊種子中，絕大部分Va分布在TAG分子中。

**和*分別表示在p＜0.01和p＜0.05水平差異極顯著。下同

圖4 SlEPX轉(zhuǎn)基因大豆種子中斑鳩菊酸（Va）在TAG和PC脂質(zhì)分子中的分布

2.4 SlEPX轉(zhuǎn)基因?qū)Υ蠖箍傊亢偷鞍缀康挠绊?/h3>

為分析種子特異表達(dá)是否對(duì)大豆種子貯藏物積累產(chǎn)生影響，分別測(cè)試了非轉(zhuǎn)基因大豆Jack和轉(zhuǎn)基因大豆種子總脂含量和蛋白含量（圖5），野生大豆Jack的總脂含量占其種子干重的21.06%，轉(zhuǎn)基因大豆的總脂含量比對(duì)照降低了5%左右，僅為其種子干重的16.84%。與非轉(zhuǎn)基因大豆相比，轉(zhuǎn)基因大豆種子蛋白含量亦降低，且比對(duì)照下降了6%左右。顯然，轉(zhuǎn)基因?qū)Υ蠖狗N子油脂和蛋白貯藏物積累構(gòu)成負(fù)效應(yīng)。

圖5 SlEPX轉(zhuǎn)基因大豆種子總脂和總蛋白質(zhì)含量

2.5 SlEPX轉(zhuǎn)基因?qū)Υ蠖拱倭Ｖ?、發(fā)芽率和種子其他表型的影響

為分析種子特異表達(dá)是否對(duì)大豆種子其他 農(nóng)藝性狀產(chǎn)生影響，分別測(cè)試了非轉(zhuǎn)基因大豆Jack和轉(zhuǎn)基因大豆種子的百粒重、發(fā)芽率、種子形態(tài)及植株表型差異（圖6），轉(zhuǎn)環(huán)氧化酶基因的大豆植株矮小，種子表皮皺縮，種子變長(zhǎng)。轉(zhuǎn)基因種子百粒重比對(duì)照J(rèn)ack種子減輕8.28%。對(duì)照和轉(zhuǎn)基因大豆種子發(fā)芽率沒(méi)有顯著差異，均高達(dá)93%—96%。與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因大豆種子粒徑＜4 mm的種子所占比例明顯增加。表明僅導(dǎo)入和種子特異表達(dá)脂肪酸環(huán)氧化酶基因，盡管能新合成一定量的高值脂肪酸Va，但也導(dǎo)致種子表皮皺縮、總脂和蛋白含量及百粒重減低等不良表型。這些不利農(nóng)藝性狀的產(chǎn)生可能與在大豆種子中新合成的Va未能有效從PC分子轉(zhuǎn)移整合到TAG分子有關(guān)。因?yàn)閂a在非原宿主細(xì)胞中產(chǎn)生、并主要積累在構(gòu)成細(xì)胞膜系統(tǒng)的PC分子中，可能影響到細(xì)胞一些正常功能。

3 討論

3.1 異源表達(dá)催化珍稀脂肪酸合成酶的表型效應(yīng)

一些野生植物種子合成積累的環(huán)氧化脂肪酸、羥化脂肪酸和共軛脂肪酸等珍稀脂肪酸（unsaturated free fatty acids，UFAs）可加工成油漆、黏合劑等多種化工產(chǎn)品，具有極其重要的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值[4,27]，一些環(huán)氧化脂肪酸還可應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)[28-29]?，F(xiàn)今，已從能高水平合成此類脂肪酸的非農(nóng)業(yè)植物中分離到多種負(fù)責(zé)合成UFAs的關(guān)鍵酶基因[30]。相關(guān)研究利用這些優(yōu)異基因，在傳統(tǒng)油料作物（品種產(chǎn)量高、種植管理技術(shù)成熟）種子中組裝特殊脂肪酸的合成途徑[31]。這樣所培育的工程油料作物及其推廣種植，就可以實(shí)現(xiàn)低成本生產(chǎn)可再生和環(huán)境友好型工業(yè)用油原料，進(jìn)而替代傳統(tǒng)的不可再生的石油資源[32]。例如，早在1998年已從斑鳩菊和琉璃菊等植物發(fā)育種子中克隆到脂肪酸環(huán)氧化酶基因[33-34]，并將這些基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，擬南芥種子合成并積累了近10%的環(huán)氧化脂肪酸[35]。在煙草愈傷中過(guò)表達(dá)源于大戟屬植物的環(huán)氧化酶基因，使煙草中積累了15%的Δ12-環(huán)氧化脂肪酸[21]。這些研究均展示了利用普通油料作物種子為平臺(tái)可持續(xù)生產(chǎn)高值特異脂肪酸的發(fā)展前景。

A：種子的發(fā)芽率；B：種子的百粒重；C：轉(zhuǎn)基因（右）和非轉(zhuǎn)基因（左）大豆種子形態(tài)；D：種子大小（粒徑）；E：轉(zhuǎn)基因（左）和非轉(zhuǎn)基因（右）大豆植株

本文對(duì)高代轉(zhuǎn)基因大豆材料種子籽粒表型分析揭示了異源種子特異表達(dá)，可使大豆種子新合成積累一定量的環(huán)氧化脂肪酸Va，但也導(dǎo)致一些不利表型。例如，與非轉(zhuǎn)基因品種Jack相比，轉(zhuǎn)基因大豆油脂總量占種子干重的比例下降了5%，蛋白質(zhì)含量下降了6%，百粒重也降低了8.28%，種子變得狹長(zhǎng)且表皮皺縮。這些性狀的變化均說(shuō)明單獨(dú)表達(dá)對(duì)大豆的生理生化活動(dòng)造成了不良的影響。類似的現(xiàn)象曾在轉(zhuǎn)基因擬南芥研究中報(bào)道，單獨(dú)表達(dá)脂肪酸環(huán)氧化酶基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因擬南芥種子不能正常發(fā)芽和生長(zhǎng)發(fā)育受損等問(wèn)題[35]。單獨(dú)表達(dá)催化羥化脂肪酸（蓖麻酸）合成的脂肪酸羥化酶基因的擬南芥[36]及表達(dá)α-桐酸合成基因的大豆體細(xì)胞胚亦出現(xiàn)負(fù)效應(yīng)[37-38]。這些報(bào)道和本文研究結(jié)果均表明異源特殊脂肪酸的合成積累會(huì)影響宿主種子的代謝和生理。一些研究顯示，蓖麻酸在異源內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成而不能有效轉(zhuǎn)運(yùn)儲(chǔ)藏于油體，就會(huì)誘導(dǎo)質(zhì)體中乙酰-CoA羧化酶活性的翻譯后抑制，從而抑制脂肪酸合成和總油脂積累[39]。本文研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆新合成的Va大部分結(jié)合在PC分子（12.6%）上，而在TAG分子中極少。新合成珍稀脂肪酸Va大量分布在膜脂PC分子中，勢(shì)必影響到宿主細(xì)胞的生命活動(dòng)，進(jìn)而導(dǎo)致大豆種子產(chǎn)生一些不利表型。

3.2 在普通油料作物種子中組裝珍稀油脂合成途徑的基因工程優(yōu)化策略

對(duì)斑鳩菊和琉璃菊發(fā)育種子中斑鳩菊酸合成積累研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)合在TAG分子而儲(chǔ)藏于油體的斑鳩菊酸含量可高達(dá)50%—80%[6-7]，相反，結(jié)合于細(xì)胞膜PC分子中的斑鳩菊酸極少。這表明，這些原產(chǎn)斑鳩菊酸的植物經(jīng)長(zhǎng)期進(jìn)化，細(xì)胞形成了獨(dú)特機(jī)制，能高效地將脂肪酸環(huán)氧化酶催化合成的結(jié)合于PC的斑鳩菊酸轉(zhuǎn)移整合到TAG分子而儲(chǔ)存于油體中。DGAT（二?；视王；D(zhuǎn)移酶）和PDAT（磷脂二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶）是控制TAG合成的最后一步酰化反應(yīng)的限速酶，它們能將CoA分子結(jié)合的?；騊C分子上sn-2位置的?；溵D(zhuǎn)移到DAG（二酰甘油）分子的sn-2位置而合成TAG分子。立體化學(xué)分析證實(shí)，斑鳩菊酸等特異脂肪酸合成后就結(jié)合在PC的sn-2位置。顯然，原產(chǎn)這些珍稀脂肪酸的植物細(xì)胞存在能特異識(shí)別這些珍稀脂肪酸酰基、并將其從PC分子轉(zhuǎn)移整合到TAG分子中的?；D(zhuǎn)移酶（DGAT和PDAT等）。這在異源植物種子中組裝原產(chǎn)于蓖麻的蓖麻酸合成途徑相關(guān)研究得到證實(shí)。例如，在擬南芥種子中特異性表達(dá)蓖麻酸羥化酶（RcFAH）時(shí)，種子新合成羥化脂肪酸（蓖麻酸），但是含量低，僅占種子油的17%，且大多數(shù)分布在細(xì)胞膜PC分子上[40-41]。與野生型擬南芥種子相比，轉(zhuǎn)的擬南芥種子油脂含量下降。將來(lái)自蓖麻發(fā)育種子或與共表達(dá)，轉(zhuǎn)基因擬南芥的油脂含量接近在蓖麻種子的水平，新合成的羥化脂肪酸含量分別上升至27%和30%[42-43]。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)李潤(rùn)植課題組與美國(guó)肯塔基大學(xué)Hildebrand實(shí)驗(yàn)室先前合作研究發(fā)現(xiàn)高積累環(huán)氧化脂肪酸Va的斑鳩菊、琉璃菊發(fā)育種子中的DGAT對(duì)Va有底物特異性，能有效將Va-酰基轉(zhuǎn)移到TAG分子中[44]。然而，大豆本身的DGAT對(duì)環(huán)氧化脂肪酸?；鶝](méi)有底物選擇性[45]。本研究檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因大豆種子雖然合成了Va，但在TAG中僅有2.3%左右，相反在PC中的Va的高達(dá)12.6%。推測(cè)轉(zhuǎn)大豆種子中Va含量低且在TAG分子積累少的原因是大豆本身缺少像斑鳩菊或琉璃菊能特異高效將環(huán)氧化脂肪酸?；鶑腃oA或PC轉(zhuǎn)入TAG的DGAT或PDAT等相關(guān)酶。據(jù)此，我們提出在大豆種子中組裝環(huán)氧化脂肪酸合成途徑的優(yōu)化策略，即在種子特異表達(dá)環(huán)氧化酶SlEPX大豆種子中，進(jìn)一步共表達(dá)來(lái)自斑鳩菊的或以及其他相關(guān)基因，能夠?qū)⒔Y(jié)合于CoA及PC分子中的Va?；行мD(zhuǎn)移到TAG分子中，大幅提高Va在種子油中的積累量。同時(shí)，消除新合成積累的Va對(duì)細(xì)胞傷害，進(jìn)而培育獲得富含環(huán)氧化脂肪酸且其他農(nóng)藝性狀優(yōu)良的大豆新種質(zhì)，為這些高值珍稀脂肪酸的規(guī)?；G色生產(chǎn)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

種子特異表達(dá)異源脂肪酸環(huán)氧化酶（SlEPX）可使大豆種子合成環(huán)氧化脂肪酸即斑鳩菊酸（Va），但含量低且有負(fù)效應(yīng)。在轉(zhuǎn)基因大豆種子中共表達(dá)或，可實(shí)現(xiàn)大幅提高Va在種子油中的積累量，并消除Va積累于細(xì)胞膜所導(dǎo)致的不利表型。

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Phenotypic analysis of epoxygenase-transgenic soybeans

HAO QingTing, ZHANG Fei, JI XiaJie, XUE JinAi, LI RunZhi

(Institute of Molecular Agriculture and Bioenergy, Shanxi Agricultural

【Objective】Epoxy fatty acids (EFAs) derived from plants are renewable materials for production of high-valued chemical products. Such unusual fatty acids (UFAs) are only highly synthesized and accumulated in some wild plant seeds, with difficult in utilization on a large scale. This study was conducted to assembly epoxy fatty acid biosynthesis pathway in developing seeds of soybean ((L.) Merr) for commercial production of these unusual fatty acids. 【Method】In this paper,, an epoxygenase gene from(a high accumulator of EFAs)was cloned into pCAMBIA1301 expression vector driven by a seed-specific promoter. Soybean (cv. Jack) was genetically transformed using the particle bombardment method based on somatic embryogenesis system. The high-generation lines of-transgenic soybean with stable phenotypes were obtained by continuous selection and identification. The integration of heterologousgene and its expression profiles were examined by PCR and Real-time quantitative PCR, respectively. Seed phenotypic examinations were statistically analyzed including seed morphology, size, 100-seed weight and germination rate. Seed oil and protein contents and other physiological properties were measured by gas chromatography and Kjeldahl method. 【Result】The results showed thatgene was stably integrated into soybean genome, with its accurate and effective expression in developing seeds of high-generation soybeans. EFAs were newly synthesized but low content (2.9%) in-transgenic soybean seeds, and linoleic acid (18﹕2Δ9,12）was accordingly reduced by 8%. Compared to the control, the transgenic soybean seeds were a little longer and wrinkled seed coat. The percentage of small seeds (diameter <4mm) was increased significantly in the transgenic soybean. Seed germination rate had no difference between transgenic and control whereas the transgenic plant exhibited slow growth. The oil and protein content as well as 100-seed weight of transgenic soybean seeds were reduced by 5%, 6% and 8.28%, respectively. Further biochemical analysis demonstrated that newly-synthesized vernolic acid (one kind of EFAs) in the transgenic seeds mostly bound to phosphatidylcholine (PC) (12.6% of total fatty acid) while only a small amount existed in triacylglycerol (TAG) (2.3%). These data indicated that heterologous SlEPX enzyme did correctly catalyze oleic acid (18﹕2Δ9,12) to vernolic acid (Va)(12-epoxy-18﹕1Δ9) in the transgenic soybean seeds. However, most of Va molecules were accumulated in PC (the major cell membrane lipid) but not in storage TAG. A large amount of Va bound to PC could damage cell membrane homeostasis, causing unfavorable phenotypes in transgenic soybeans. 【Conclusion】The present study revealed that the overexpression of a heterologous epoxygenase alone in soybean developing seeds can catalyze biosynthesis of EFAs at small amount, but results in some undesirable agronomy traits. It is needed to further co-express the acyltransferase that can specifically transfer the Va-acyl group from PC into TAG molecules in-transgenic soybean for enriching epoxy fatty acids in TAG and simultaneously, to eliminate negative effect caused by EFA accumulation in cell membrane.

L.; epoxy fatty acids; epoxygenase; transgenic soybean; phenotype analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.001

2018-07-13；

2018-10-11

國(guó)家自然科學(xué)基金（31401430）、國(guó)家“948”計(jì)劃（2014-Z39）、山西省煤炭重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（FT-2014-01）、山西省重點(diǎn)研究發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（201603D312005）、山西省留學(xué)基金委研究項(xiàng)目（2015-064）

郝青婷，E-mail：957108583@qq.com。張飛，E-mail：18235445421@163.com。郝青婷和張飛為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者李潤(rùn)植，E-mail：rli2001@126.com

（責(zé)任編輯 李莉）