食品中單核細胞增生李斯特氏菌檢出能力驗證結果與分析

◎ 殷 歡，梁梅娟，蘇佩冰，陳靖欣

（中山市食品藥品檢驗所，廣東 中山 528437）

單核細胞增生李斯特菌（以下簡稱單增李斯特菌）在自然界中廣泛分布，是一種食源性疾病的致病菌并能夠引起人畜共患病。在食品中存在的單增李斯特菌對人類的健康產生威脅，引起新生兒腦膜炎及成人敗血病等疾病。單增李斯特菌能夠在冷藏溫度下生長，在肉類、蔬菜水果、乳制品以及海產品等冷藏食品中檢出率較高，已成為食物保鮮中過程中存在的安全隱患[1]。美國疾病預防控制中心（CDC）網站上陸續報道了從2011年7月31日出現首例單增李斯特菌病例報告至同年12月8日，感染人數多達147例，死亡33例[2]。2018年7月9日英國《每日郵報》報道，近期，歐洲李斯特氏菌感染爆發，一批被李斯特氏病菌污染的冰凍甜玉米已導致47人患病，其中9人死亡[3]。2018年11月22日，歐盟食品和飼料快速預警系統（RASFF）發布4則涉及產品疑含李斯特菌的警示通報，產品為匈牙利的熏培根、奧地利的牛肉片、波蘭的熏挪威三文魚[4]。由單增李斯特菌導致的食源性疾病的爆發以及帶來的潛在風險警示我們，在食品檢驗過程中準確快速檢出單增李斯特菌具有極其重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

樣品編號為M228d02A、M228d02B，樣品狀態為密封瓶裝固體，樣品數量為2份。

1.2 實驗試劑

本次實驗所用的培養基、即用型血瓊脂平板、生化鑒定管套裝購自北京陸橋技術有限責任公司；李斯特顯色培養基由科瑪嘉公司生產。革蘭氏陽性細菌鑒定卡GP卡，AIPLAB軟件，APIListeria 10300試劑盒由法國生物梅里埃公司提供。全自動微生物基因指紋鑒定系統（RiboPrinter）配套試劑由美國杜邦公司提供。

1.3 實驗儀器

全自動微生物生化鑒定系統（VITEK2-Compact），購自法國生物梅里埃公司；RiboPrinter全自動微生物基因指紋鑒定系統，購自美國杜邦公司；SSW-600-2S型電熱恒溫水槽，購自上海博訊實業有限公司；SG603A-HE型生物安全柜，購自美國BAKER公司；拍打式均質器，購自法國interscience公司；RCT Basic型磁力攪拌器和MS3基本型圓周振蕩器，均購自廣州艾卡儀器設備有限公司；細菌鏡檢設備是日本奧林巴斯生產的CX41型生物顯微鏡；BD260型電熱恒溫培養箱，購自德國賓得公司； HVA-85型高壓滅菌器，購自日本Hirayama公司。

1.4 實驗方法

按照《雞肉中李斯特菌屬、單增李斯特菌檢驗（定性）能力驗證》樣品作業指導書的要求對樣品進行檢測前處理，并依據GB 4789.30-2016 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗進行增菌，分離，初篩以及鑒定。同時以APIListeria 10300試劑盒、全自動微生物生化鑒定系統（VITEK2- Compact）和全自動微生物基因指紋圖譜鑒定系統（RiboPrinter）進行菌種鑒定，最終綜合以上試驗結果報告。檢驗流程見圖1，同時以單增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌作為陽性對照菌進行試驗。以英諾克李斯特氏菌作為陰性對照菌。

圖1 檢驗流程圖

1.4.1 樣品前處理

將20 mL BPW加入到每個樣品瓶中，輕輕顛倒幾次后靜置30 min使樣品瓶中雞肉液化。

1.4.2 檢樣

樣品瓶中液體全部轉移至225 mL LB1增菌液中，均質后至于30 ℃培養箱，培養24 h。吸取0.1 mL樣品勻液加入到10 mL LB2增菌液中，至于30 ℃培養箱，培養24 h。取LB2二次增菌液劃線接種于李斯特氏菌顯色平板和PALCAM瓊脂平板，于36 ℃培養24～48 h，觀察各個平板上生長的菌落。記錄觀察24～48 h菌落的生長狀態。

1.4.3 初篩

自選擇性瓊脂平板上分別挑取3～5個典型或可疑菌落，分別接種木糖、鼠李糖發酵管， 于36 ℃培養24 h，同時在TSA-YE平板上劃線，于36 ℃培養24 h，然后選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養物繼續進行鑒定。

1.4.4 鑒定

根據GB 4789.30-2016中傳統鑒定方法的要求，對可疑菌株革蘭氏染色鏡檢、SIM培養基動力試驗、生化鑒定。主要包括木糖、鼠李糖、過氧化氫酶試驗、七葉苷試驗、甘露醇試驗、溶血試驗、協同溶血試驗、麥芽糖試驗、葡萄糖試驗、MR-VP試驗。

1.4.5 API法鑒定

按照產品說明書進行操作，36 ℃孵育24 h后取出。

1.4.6 全自動微生物生化鑒定系統(VITEK2-Compact)鑒定

分別從TSA平板上挑取單個菌落，制成符合儀器濁度的菌懸液。用GP鑒定卡，按照儀器操作規程，采用VITEK2-Compact菌種鑒定系統進行鑒定。

1.4.7 全自動微生物基因指紋圖譜鑒定系統（RiboPrinter）鑒定

挑取新鮮菌落1～3個，懸浮于40 μL樣品緩沖液中， 混勻后吸取30μL于樣品杯中， 熱滅活后各加入5 μL裂解液A和裂解液B，放置于RiboPrinter 樣品孔中。運行程序，選用 EcoR I酶切系統。雜交圖譜選擇與DuPont ID數據庫進行比對，得出待測菌株信息。

2 結果與分析

國家標準法中傳統鑒定方法作為標準評價API法、全自動微生物生化鑒定系統（VITEK2-Compact）和全自動微生物基因指紋鑒定系統（RiboPrinter）。四種方法均能準確在編號為M228d02A 的樣品中檢出單增李斯特菌。API法、全自動微生物生化鑒定系統（VITEK2-Compact）和全自動微生物基因指紋鑒定系統（RiboPrinter）在培養和鑒定耗時方面有明顯優勢。具體情況見表1。

表1 單增李斯特菌檢出過程表

3 討論

采用食品安全國家標準方法中的傳統方法來檢測單增李斯特菌，分離鑒定方法較簡單但是操作繁瑣費時費力，一般需要5～7 d完成，難以滿足快速檢測的需求[5]。對于菌落的觀察、溶血試驗及協同溶血試驗等內容對操作人員的能力有一定的考驗。同時傳統國家標準法的生化鑒定管一般采用安瓿瓶，操作過程容易劃傷操作人員的手。API法通過制作菌懸液一次接種試劑條培養即可，培養后通過觀察自然反應以及加入附加試劑的變色反應來判定酶以及糖發酵產物的反應結果。操作過程耗時較少、操作簡單安全。API法有效地彌補了傳統檢測方法中的不足之處，有效提高檢測時效及準確率，特別適合從事微生物檢驗工作初期的檢驗人員[6]。全自動微生物生化鑒定系統（VITEK2-Compact）和全自動微生物基因指紋鑒定系統（RiboPrinter）在操作和鑒定用時方面有明顯優勢，通過分離出的可疑菌株的純培養物進行快速鑒定。本試驗通過使用多種方法對可疑的典型菌落均做出了正確的判斷，方法之間可以互相佐證，為快速鑒定單增李斯特菌提供多種可行性。因此，API Listeria李斯特菌鑒定試劑盒、全自動微生物生化鑒定系統（VITEK2-Compact）以及全自動微生物基因指紋圖譜鑒定系統（RiboPrinter）等越來越多自動化、系統化的方法被應用在單增李斯特菌的檢測中。