蒽酮-硫酸法與苯酚-硫酸法測定苦瓜多糖的比較

◎ 張潔媛，張 麗，寧恩創(chuàng)

（1.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530000；2.南寧市第一職業(yè)技術(shù)學校，廣西 南寧 530000）

1 材料及方法

1.1 材料

基本材料苦瓜粉，顏色為淡黃綠色，易溶于水，目數(shù)在100～150目，不含任何添加劑和防腐劑；試劑選擇蒽酮、苯酚、硫酸和無水葡萄糖；儀器選擇電子天平、紫外可見分光光度計、電磁爐。其余的試劑和儀器按照基本配備。

1.2 苦瓜多糖的提取

苦瓜多糖是苦瓜中的一種有效活性成分，在對苦瓜多糖提取方法的研究中，使用較多的是熱水浸提法，以熱水浸提，然后用乙醇進行沉淀。超聲波提取法，操作方法與常規(guī)方法相同，只需增加使用超聲波儀器，無需其他試劑，便可使多糖的提取率提高，粗多糖中多糖的含量也提高。在本次實驗中，選取超聲波浸提法對苦瓜多糖進行浸提[1]。超聲波提取苦瓜多糖的主要過程為：苦瓜粉→乙醇回流→超聲波浸提→過濾→濃縮→醇析→洗滌→干燥→苦瓜粗多糖。

1.3 苯酚-硫酸法測定苦瓜多糖

糖在濃硫酸作用下，水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚縮合成橙黃色化合物，且顏色穩(wěn)定，在最大吸收波長處和一定的濃度范圍內(nèi)，其吸光度與多糖含量呈正比關(guān)系，可以利用分光光度計測定其吸光度，并利用標準曲線定量測定樣品的多糖含量。

1.3.1 單因素實驗

影響苯酚-硫酸法測定苦瓜多糖的因素有5%苯酚的量、濃硫酸的量、反應(yīng)時間、最大吸收波長，結(jié)合4個因素的影響設(shè)計單因素實驗，確定最適的條件。

1.3.1.1 5%苯酚試劑的量

取11支具塞試管，其中一支做空白。10支分別加入0.5 mL的0.408 4 mg·mL-1的樣品，加入1.5 mL的蒸餾水，空白加入2 mL蒸餾水，所有試管中再加入1 mL的苯酚試劑，再加入6 mL的濃硫酸；1號、2號試管加入0.6 mL的5%苯酚試劑；3號、4號試管加入0.8 mL的5%苯酚試劑；5號、6號試管加入1.0 mL的5%苯酚試劑；7號、8號加入1.2 mL的5%苯酚試劑；9號、10號加入1.4 mL的5%苯酚溶液。再每支試管中加入6 mL的濃硫酸，室溫下放置30 min，在波長為490 nm的條件下進行實驗。

1.3.1.2 濃硫酸的量

取11支試管，其中一支作為空白。10支分別加入0.5 mL的0.408 4 mg·mL-1的樣品，加入1.5 mL的蒸餾水，空白加入2 mL蒸餾水，所有試管中再加入1 mL的苯酚試劑；每支試管中加入1 mL的5%苯酚試劑。1號、2號試管中加入5.0 mL的濃硫酸；3號、4號試管中加入5.5 mL的濃硫酸；5號、6號試管中加入6.0 mL的濃硫酸；7號、8號試管加入6.5 mL的濃硫酸；9號、10號試管中加入7.0 mL的濃硫酸。室溫下放置30 min，在波長為490 nm的條件下進行實驗。

1.3.1.3 反應(yīng)時間

取11支試管，其中一支作為空白。10支分別加入0.5 mL的0.408 4 mg·mL-1的樣品，加入的濃硫酸；1號、2號試管在常溫下放置20 min后在490 nm的波長下進行測定；3號、4號試管在常溫下放置25 min后在490 nm的波長下進行測定；5號、6號試管在室溫下放置30 min后在490 nm的波長下進行測定；7號、8號試管在室溫下放置35 min后在490 nm的波長下進行測定；9號、10號試管再室溫下放置40 min后在490 nm的波長下進行測定。

1.3.1.4 最適波長的選擇

取11支試管，其中一支作為空白。10支分別加入0.5 mL的0.408 4 mg·mL-1的樣品，加入1.5 mL的蒸餾水，空白加入2 mL蒸餾水，所有試管中再加入1 mL的苯酚試劑，再加入6 mL的濃硫酸，室溫下放置30 min，1號、2號試管在波長470 nm處進行測定；3號、4號試管在波長480 nm處進行測定；5號、6號試管在波長為490 nm處進行測定；7號、8號試管在波長500 nm處進行測定；9號、10號試管在波長為510 nm處進行測定。

1.3.2 正交試驗

根據(jù)單因素實驗確定設(shè)定正交實驗因素水平，見表1。

表1 苦瓜多糖含量的測定正交試驗因素水平表

確定正交實驗因素水平后，根據(jù)正交表規(guī)律確定正交表，見表2。

表2 L9（33）苦瓜多糖含量的測定正交試驗表

取一支空白加入2 mL蒸餾水，再加入1 mL的苯酚試劑，再加入5 mL的濃硫酸，室溫下放置30 min。1～9號試管按正交試驗表中的安排進行試劑的添加，在規(guī)定的時間內(nèi)進行測定。

1.4 蒽酮-硫酸法測定苦瓜多糖

糖類在較高溫度下可與濃硫酸發(fā)生脫水反應(yīng)生成糠醛，羥甲基糖醛后與蒽酮（C14H10O）脫水縮合，形成糠醛的衍生物，呈藍綠色。該物質(zhì)在620 nm處有最大吸收，在0～150 μg·mL-1，其顏色的深淺與可溶性糖含量成正比。蒽酮試劑：精密稱取0.1 g蒽酮，加80%濃H2SO4100 mL使之溶解，搖勻[2]。

根據(jù)蒽酮-硫酸法測定苦瓜多糖的原理可知，影響實驗結(jié)果的因素有蒽酮試劑的量、沸水浴的時間、最大吸收波長。通過3組單因素實驗，確定單個因素的最適合條件。通過單因素實驗的結(jié)果，再進行正交試驗，通過對正交試驗結(jié)果的分析，得到一個最適的組合，作為兩種方法最后進行比較的條件。（具體測定與苯酚-硫酸法測定苦瓜多糖類似）

2 結(jié)果與分析

2.1 標注曲線的繪制

（1）苯酚-硫酸法測定苦瓜多糖的標準曲線的繪制。取6支試管，分別加入0.0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL和1.0 mL的標準葡萄糖溶液，加入蒸餾水至2 mL，再加入5%苯酚0.8 mL，濃硫酸6 mL，室溫下反應(yīng)30 min，使用紫外可見分光光度計在480 nm的波長下進行測定，試驗結(jié)果繪制成曲線如圖1所示。

圖1 苯酚硫酸法的標準曲線圖

（2）蒽酮-硫酸法測定苦瓜多糖的標準曲線的繪制。取6支試管，分別加入0.0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL及1 mL的標準葡萄糖溶液，加蒸餾水至2 mL，再加入5.0 mL的蒽酮試劑，沸水浴15 min后冰水浴15 min，使用紫外可見分光光度計在620 nm的波長下進行測定，得到圖2結(jié)果。

圖2 蒽酮硫酸法的標準曲線圖

2.2 實驗結(jié)果與討論

根據(jù)圖1和圖2所得數(shù)據(jù)，通過計算得出多糖含量，然后計算得出每種方法的RSD值。苯酚-硫酸法測定苦瓜多糖的穩(wěn)定性、精密度和回收率都比蒽酮-硫酸法高，但是重復性沒有蒽酮-硫酸法好。所以，苯酚-硫酸法更適合用于苦瓜多糖的測定[3]。

所以，兩種方法中苯酚-硫酸法相比于蒽酮-硫酸法回收率較高。

由表3、表4、表5和表6可知，苯酚-硫酸法測定苦瓜多糖比蒽酮-硫酸法測定苦瓜多糖的穩(wěn)定性、精密度和回收率都比蒽酮-硫酸法高，但重復性沒有蒽酮-硫酸法好。所以，苯酚-硫酸法更適合用于苦瓜多糖的測定。

表3 蒽酮-硫酸法與苯酚硫酸法測定苦瓜多糖的穩(wěn)定性比較表

表4 蒽酮-硫酸法與苯酚硫酸法測定苦瓜多糖的精密度比較表

表5 蒽酮-硫酸法與苯酚硫酸法測定苦瓜多糖的重復性比較表

表6 蒽酮-硫酸法與苯酚硫酸法測定苦瓜多糖的回收率比較表

3 討論

因為苯酚-硫酸法加入苯酚試劑和濃硫酸是分開加入，兩者之間互相影響較小，而且是先加入苯酚試劑，再加入濃硫酸，反應(yīng)從加入濃硫酸開始進行。反應(yīng)的進行不再需要進行外界加熱，濃硫酸與溶液反應(yīng)放出的熱量足夠讓反應(yīng)得以進行。反應(yīng)進行30 min后基本結(jié)束，生成了穩(wěn)定的橙黃色化合物，再繼續(xù)放置不會再發(fā)生反應(yīng)，所以穩(wěn)定性和精密度比較好。反應(yīng)進行得較為完全，所以回收率也比較高。而加入的試劑次數(shù)較多，每次加入試劑都會帶來誤差，導致重復性偏低。

在蒽酮-硫酸法測定苦瓜多糖的過程中，蒽酮試劑的加入標志著反應(yīng)的開始，而11支試管不可能同時加入蒽酮試劑，在沸水浴之前，由于濃硫酸與溶液的反應(yīng)放出的熱使反應(yīng)提前進行。所以樣品的反應(yīng)進行不同步，由于操作的不同，每次的反應(yīng)時間不一樣，所以精密度比較低。冰水浴后進行測定時，隨著時間的推移，溫度的回升，反應(yīng)又得以進行，吸光值會變動，所以穩(wěn)定性較差。在最適的反應(yīng)條件下反應(yīng)進行的不徹底，導致回收率偏低。由于單支試管進行實驗時，只需加入蒽酮試劑，反應(yīng)時間得到準確的控制，測定時可以得到一個穩(wěn)定的值，所以蒽酮-硫酸法的重復性比較好。